A Giardia duodenum é un organismo parasitario que causa a xiardíase, unha infección intestinal especialmente común en nenos pequenos con signos clínicos de diarrea.Informamos previamente de que G. duodenalis extracelular desencadea a activación dos nucleótidos de unión do receptor 3 (NLRP3) tipo oligomerización intracelular e regula as respostas inflamatorias do hóspede mediante a secreción de vesículas extracelulares (EV).Non obstante, aínda quedan por dilucidar os patróns moleculares exactos do EV duodenocócico asociado a patóxenos (GEV) implicado neste proceso e o papel do inflamasoma NLRP3 na xiardíase.
Construíronse plásmidos de expresión eucariotas recombinantes pcDNA3.1(+)-alfa-2 e alfa-7.3 giardinas en GEV, transfectáronse en macrófagos peritoneais primarios de rato e detectáronse medindo a molécula diana da inflamación caspase-1.Analizouse o nivel de expresión de p20..G. duodenalis alfa-2 e alfa-7.3 giardinas identificáronse orixinalmente medindo o inflamasoma NLRP3 (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 e caspase-1 p20), a secreción de IL.1β, niveis de oligomerización da proteína apoptótica manchada (ASC) e localización inmunofluorescente de NLRP3 e ASC.A continuación, avaliouse o papel do inflamasoma NLRP3 na patoxenicidade de G. duodenalis utilizando ratos nos que se bloqueou a activación de NLRP3 (ratos bloqueados NLRP3) e monitorizáronse os cambios patolóxicos no peso corporal, a carga parasitaria duodenal e o tecido duodenal.Ademais, investigamos se as hiardinas alfa-2 e alfa-7.3 inducen a secreción de IL-1β in vivo a través do inflamasoma NLRP3 e determinamos o papel destas moléculas na patoxenicidade de G. duodenalis en ratos.
As giardinas alfa-2 e alfa-7.3 inducen a activación do inflamasoma NLRP3 in vitro.Isto levou á activación da p20 caspase-1, un aumento dos niveis de expresión das proteínas NLRP3, pro-IL-1β e pro-caspase-1, un aumento significativo da secreción de IL-1β, a formación de manchas de ASA no citoplasma e a indución da oligomerización de ASA.Inflamación de NLRP3 A perda do pene exacerba a patoxenicidade de G. duodenalis en ratos.Os ratos tratados con quistes por sonda de ratos bloqueados con NLRP3 mostraron un maior número de trofozoítos e danos graves nas vellosidades duodenais, caracterizados por criptas necróticas con encollemento e ramificación.Experimentos in vivo demostraron que as giardinas alfa-2 e alfa-7.3 poden inducir a secreción de IL-1β a través do inflamasoma NLRP3, e a inmunización con giardinas alfa-2 e alfa-7.3 reduciu a patoxenicidade de G. duodenalis en ratos.
En conxunto, os resultados deste estudo suxiren que a giardia alfa-2 e a alfa-7.3 causan unha regulación positiva da inflamación NLRP3 do hóspede e reducen a infecciosidade de G. duodenalis en ratos, que son obxectivos prometedores para previr a xiardíase.
Giardia duodenum é un protozoo parasito extracelular que vive no intestino delgado e causa 280 millóns de casos de xiardíase con diarrea ao ano, especialmente entre os nenos pequenos dos países en desenvolvemento [1].As persoas inféctanse ao beber auga ou alimentos contaminados con quistes de M. duodenum, que despois entran no estómago e son excretados nos zumes gástricos.Os trofozoitos de Giardia duodenum únense ao epitelio duodenal, causando náuseas, vómitos, diarrea, dor abdominal e perda de peso.As persoas con inmunodeficiencia e fibrose quística son susceptibles á infección.A infección tamén pode ocorrer a través do sexo oral e anal [2].Fármacos como metronidazol, tinidazol e nitazoxanida son as opcións de tratamento preferidas para as infeccións duodenais [3].Non obstante, estes fármacos de quimioterapia causan efectos secundarios adversos como náuseas, carcinoxénese e xenotoxicidade [4].Polo tanto, é necesario desenvolver estratexias máis eficaces para previr a infección por G. duodenalis.
Os inflamasomas son unha clase de complexos proteicos citosólicos que forman parte da resposta inmune innata, axudando a defenderse contra a invasión de patóxenos e a mediar nas respostas inflamatorias [5].Entre estes inflamasomas, o receptor 3 de oligomerización de unión de nucleótidos (NOD) (NLRP3) o inflammasoma de unión de nucleótidos (NLRP3) foi amplamente estudado porque pode ser detectado por varios patróns moleculares asociados a patóxenos/danos (PAMP/). DAMP), recoñece, activa o sistema inmunitario innato.e regula a homeostase intestinal en moitas enfermidades inflamatorias [6,7,8].Consta do receptor de recoñecemento de patróns (PRR) NLRP3, unha proteína adaptadora apoptótica manchada (ASC) e unha procaspase-1 efectora ou procaspase-11.O inflamasoma NLRP3 actúa como hospedador contra a invasión de patóxenos, como se observa nos estudos de Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] e Leishmania.[11], pero tamén se informou de que a activación do inflamasoma NLRP3 limita as respostas inmunitarias protectoras e exacerba a progresión da enfermidade, por exemplo, nos vermes [12].Con base nos nosos descubrimentos anteriores, informamos de que G. duodenalis extracelular desencadea a activación intracelular da inflamación de NLRP3 e modula as respostas inflamatorias do hóspede segregando vesículas extracelulares (EV) [13].Non obstante, aínda está por determinar o papel do inflamasoma NLRP3 na infección por G. duodenalis in vivo.
Os Giardins foron descritos orixinalmente como compoñentes estruturais do citoesqueleto de G. duodenalis e desempeñan un papel importante na motilidade do trofozoíto e na unión das células epiteliais no intestino delgado.Para adaptarse mellor ao medio e aumentar a súa patoxenicidade, os trofozoítos de G. duodenalis desenvolveron unha estrutura citoesquelética única formada por 8 flaxelos, 1 corpo medio e 1 disco ventral [14].Os trofozoítos de Giardia duodenum usan o seu citoesqueleto para penetrar no intestino delgado superior, especialmente no duodeno, e unirse aos enterocitos.Migran constantemente e únense ás células epiteliais mediante o metabolismo celular.Polo tanto, existe unha estreita relación entre o seu citoesqueleto e a virulencia.Os giardini específicos para Giardia duodenum son compoñentes da estrutura do citoesqueleto [15] e divídense en catro clases: α-, β-, γ- e δ-giardines.Hai 21 membros da familia das α-giardinas, todos eles teñen unha capacidade dependente do calcio para unirse aos fosfolípidos [16].Tamén conectan o citoesqueleto coa membrana celular.En individuos con diarrea causada por G. duodenalis, as α-giardinas están moi expresadas e inmunorreactivas durante a infección [17].As vacinas heterólogas baseadas en Giardia alfa-1 protexen contra a xiardíase en ratos e son antíxenos candidatos potenciais para o desenvolvemento de vacinas [18].A giardina alfa-8, localizada na membrana plasmática e flaxelos, pero non no disco ventral, mellora a motilidade e a taxa de crecemento dos trofozoítos en G. duodenalis [19].A giardina alfa-14 únese ás estruturas de microtúbulos dos flaxelos e afecta a viabilidade de G. duodenalis [20].A giardina alfa-11 está presente en abundancia durante todo o ciclo de vida, e a sobreexpresión da giardina alfa-11 danos a G. duodenalis en si [21].Non obstante, non está claro se a giardina alfa-2 e a giardina alfa-7.3 protexen contra a infección por G. duodenalis e os seus mecanismos subxacentes.
Neste estudo, os plásmidos de expresión eucariotas recombinantes pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine e pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine transfectáronse en macrófagos peritoneais primarios de rato para activar o hóspede NLRP3.Despois cribáronse os obxectivos de inflamasoma.Tamén avaliamos o papel do inflamasoma NLRP3 na patoxenicidade de G. duodenalis, investigamos se as giardinas alfa-2 e alfa-7,3 inducen a activación do inflamasoma NLRP3 in vivo e determinamos que estes dous papeis das giardinas na patoxenicidade de G. duodenalis.O noso obxectivo común era desenvolver obxectivos prometedores para a prevención da infección por G. duodenalis.
Os ratos femias C57BL/6 de tipo salvaxe (WT) con idades comprendidas entre 5 e 8 semanas foron adquiridos no Centro Experimental de Animales de Liaoning Changsheng (Liaoning, China).Os ratos tiñan acceso libre á auga, recibían comida esterilizada e mantivéronse nun ciclo de luz/escuro de 12/12 horas.Antes da infección, os ratos recibían antibióticos ad libitum en auga potable complementados con ampicilina (1 mg/ml), vancomicina (1 mg/ml) e neomicina (1,4 mg/ml) (todos comprados en Shanghai, China, organismos artificiais) [22]. ].].Os ratos que perderon a capacidade de comer e beber durante > 24 horas e perderon ≥ 20 % do peso corporal foron sacrificados humanamente por luxación cervical.
Os trofozoítos de WB G. duodenalis (American Type Culture Collection, Manassas, EUA) foron complementados con 12,5% de suero fetal bovino (FBS; Every Green, Zhejiang, China) e 0,1% de bile bovina (Sigma-Aldrich, St. Missouri, EUA). ).EUA) en condicións microaeróbicas.Os trofozoítos confluentes recolléronse en xeo e pasáronse nunha proporción de 1:4 para a súa posterior reprodución.
Os quistes de Giardia duodenum foron inducidos como se describiu anteriormente [23], os trofozoítos recolléronse en fase logarítmica e despois diluíronse cun medio inductor de encapsulación, pH 7,1 (TYI-S-33 modificado) ata unha concentración final de 1 × 106 trofozoítos/ml.concentración biliar 0,05% media).Os trofozoítos cultiváronse en condicións anaeróbicas a 37 °C ata a fase de crecemento logarítmico.Cambia o medio por medio inductor de cistos (pH 7,8; ​​medio TYI-S-33 modificado cunha concentración de bilis do 1%) e cultiva G. duodenalis a 37 °C durante 48-96 horas, durante as cales se observaron os quistes de formación ao microscopio.Despois de que a maioría dos trofozoítos foran inducidos a formar quistes, a mestura de cultivo foi recollida e resuspendida en auga desionizada estéril para lisar os trofozoítos restantes.Os quistes foron contados e almacenados a 4 ° C para as análises posteriores a través dunha sonda gástrica en ratos.
As vesículas extracelulares de Giardia (GEV) enriquecéronse como se describiu anteriormente [13].Os trofozoítos en fase de crecemento logarítmico foron resuspendidos en medio TYI-S-33 modificado preparado con FBS empobrecido en exosomas (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) ata unha concentración final de 1 × 106 parasitos/mL e incubáronse durante 12 horas.illáronse do sobrenadante do cultivo mediante centrifugación a 2000 g durante 10 min, 10.000 g durante 45 min e 100.000 g durante 60 min.Os precipitados disolvéronse en solución salina tamponada con fosfato (PBS), cuantificáronse mediante un kit de ensaio de proteínas BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) e almacenáronse a -80 °C ou empregáronse directamente para análises posteriores.
Os macrófagos peritoneais primarios de rato preparáronse como se describiu anteriormente [24].Brevemente, os ratos (de 6 a 8 semanas) foron inxectados (intraperitonealmente [ip]) con 2,5 ml de medio de tioglicol líquido Difco ao 2,98% (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA) e alimentáronse 3-4 padais.Unha suspensión de macrófagos foi recollida da cavidade abdominal dos ratos despois da eutanasia e centrifugada 3 veces a 1000 g durante 10 min.As células recollidas detectáronse mediante citometría de fluxo usando o marcador CD11b ata que a pureza celular foi > 98 %, despois engadíronse a placas de cultivo celular de 6 pocillos (4,5 x 106 células/pozo) e incubáronse con FBS (Bioindustry) ao 10 % a 37 °C.e 5% CO2.
O ARN foi extraído de 1 × 107 trofozoítos en 1 ml de reactivo TRIzol (Vazyme, Nanjing, China), o ADN xenómico foi extraído do ARN total de G. duodenalis usando MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, China) e sintetizouse ADN complementario (cDNA). usando MonScript RTIIII Super Mix (Monad) segundo as instrucións do fabricante.
A información da secuencia CDS para o xene diana de G. duodenalis obtívose do NCBI GenBank.Use Primer 5.0 para deseñar cebadores específicos de clonación sen fisuras para cada xene diana.O cebador directo (5′-3′) consta de tres partes: unha secuencia superposta cun vector linealizado pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) e codóns de inicio ATG e GNN (se a primeira base non é G).Isto faise para mellorar a eficiencia da expresión.Ademais, polo menos 16 pb bases combinadas (contido de GC 40–60%/Tm aprox. 55 °C).O cebador inverso (5′-3′) consta de dúas partes, unha secuencia superposta cun vector pcDNA3.1(+) linealizado por EcoRV (GCCGCCACTGTGCTGGAT) e unha base combinada de polo menos 16 pb.(excluídas as dúas últimas paradas).bases) un codón como AA ou GA para permitir que os plásmidos recombinantes expresen as súas proteínas marcadas).As secuencias de cebadores están listadas na Táboa 1 e foron sintetizadas por Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, China).
Os obxectivos foron amplificados usando ADN polimerase Pfu (Tiangen, Beijing, China) ou Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) usando ADNc de G. duodenalis preparado como modelo.O plásmido vector de expresión eucariota pcDNA3.1(+) foi linealizado co encima de restrición EcoRV e desfosforilado usando Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Os fragmentos linearizados de pcDNA3.1(+) e os fragmentos de xenes diana amplificados purificáronse mediante un kit de purificación de xel de ADN (Tiangen) e cuantificáronse mediante un Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).O fragmento pcDNA3.1(+) e cada fragmento de xene diana recombináronse utilizando unha mestura de clonación de conxunto único MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) e confirmáronse mediante a secuenciación de ADN usando Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China)..
Os plásmidos libres de endotoxinas pcDNA3.1(+)-alfa-2 e pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 foron xerados usando o SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).A concentración mantívose por riba de 500 ng/µl para garantir que o EDTA no tampón de elución non interferise co ensaio de transfección.Cultiváronse os macrófagos peritoneais primarios de rato en placas de 6 pocillos con medio RPMI 1640 completo (Industrias Biolóxicas) durante 12 horas, despois laváronse as células 3 veces en PBS quente para eliminar a penicilina e a estreptomicina, e despois en medio complementado con medio completo.Os plásmidos libres de endotoxinas pcDNA3.1(+)-alfa-2 e pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (2,5 μg) diluíronse en 125 μl de medio de soro reducido Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..A continuación, diluíronse 5 µl de reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) en 125 µl de medio Opti-MEM baixo en soro.Prepare complexos liposomas-ADN mesturando o plásmido libre de endotoxinas diluído con Lipofectamine 2000 e deixando que a mestura repousa a temperatura ambiente durante 5 minutos.Transferir os complexos por separado ás células de cada pozo e mesturar lentamente.Despois de 4 horas, o medio de cultivo celular foi substituído por 2 ml de medio RPMI 1640 completo e o cultivo continuou durante 24 horas.Engadiuse medio de cultivo de células frescas ás células e incubouse durante varios puntos de tempo dependendo do deseño do ensaio.
As mostras de proteínas de sobrenadantes e lisados ​​celulares preparáronse como se describiu anteriormente [25].Os parámetros de transferencia de membrana para pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actina e His-tag foron 200 mA/90 min.Para interleucina 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, EE. UU.), caspase-1 (p20) (Adipogen, Suíza) e NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Suíza) e 1:5000 dirixido a His tag (Amylet Scientific, Wuhan, China) e β-actina (Proteintech, Wuhan, China).
A reticulación con suberato de disuccinimida (DSS) realizouse como se describiu anteriormente [26].As células laváronse 3 veces con PBS frío e lisáronse completamente cunha agulla de calibre 27 en 50 µl de tampón de reacción ASC (pH 8,0) que contén 25 mM de Na2PO4, 187,5 mM de NaCl, 25 mM de HEPES e 125 mM de NaHCO3.A mestura centrifugouse a 5000 g durante 3 min e o sedimento foi suturado con 10 µl de DSS (25 mM en DMSO) e 40 µl de tampón de reacción ASC durante 30 min a 37 °C.Despois da centrifugación a 5000 g durante 10 min, o sedimento disolveuse nunha solución de 40 µl de tampón de reacción ASC e 10 µl de tampón de carga de proteínas 6x (TransGen, Beijing, China), e despois a solución foi apagada a temperatura ambiente durante 15 minutos. min., Despois ferva 10 minutos.As mostras de proteínas foron sometidas a transferencia Western usando anticorpos anti-ASC primarios (Wanleibio, Shenyang, China) nunha proporción de dilución de 1:500.
Seguindo un procedemento descrito previamente [13], recolléronse sobrenadantes de cultivo celular e determinouse a secreción da citocina proinflamatoria IL-1β mediante o kit ELISA IL-1 Beta de rato (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Converte os valores de OD450nm en concentracións de proteínas usando a curva estándar IL-1β.
As células recubertas de cubreobjetos laváronse suavemente 3 veces en PBS quente, fixadas en fixador celular de tecidos (Biosharp, Beijing, China) durante 10 min a temperatura ambiente (RT), en Triton X-Permeabilize ao 0,1% a 100 (diluído en PBS; Biosharp). ) durante 20 minutos a temperatura ambiente e bloquear en albúmina sérica bovina ao 5% (en PBS) durante 2 horas a temperatura ambiente.Despois, as células incubáronse durante a noite a 4 °C con anticorpos primarios contra ASC (dilución 1:100) ou NLRP3 (dilución 1:100), respectivamente, e IgG anti-coello de cabra marcada con Cy3 (H+L) (1:400; EarthOx). , San Francisco, CA, EUA) ou IgG anti-rato de cabra conxugada con FITC (1:400; Earthox) durante a noite a 37 °C na escuridade durante 1 hora.Os núcleos tinguironse con Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, China) durante 5 minutos e observáronse nun microscopio de fluorescencia (Olympus Corporation, Tokio, Xapón).
Os ratos dividíronse en catro grupos (n = 7 en cada grupo): (i) Grupo de control negativo tratado con PBS (só PBS; sondaxe de 100 µl/rato de PBS seguido dunha inxección intraperitoneal diaria de 100 µl/rato de PBS 3 horas máis tarde)., continuamente durante 7 días);(ii) grupo de control negativo tratado con inhibidor de MCC950 [27] (100 µl/rato mediante sonda PBS, 3 horas despois, 10 mg/kg de peso corporal [BW] MCC950 [en PBS] administráronse por vía intraperitoneal diariamente, duración 7 días);(iii) Grupo de infección por quiste G. duodenalis (1,5 x 106 quistes/rato por sonda, 3 horas despois, 100 μl/rato de PBS por vía intraperitoneal diariamente durante 7 días);(iv) Grupo de infección combinada de quiste de G. duodenalis Grupo de tratamento con inhibidores de MCC950 (1,5 × 106 quistes/rato por sonda, 10 mg/kg de peso corporal MCC950 intraperitonealmente diariamente durante 7 días ás 3 h).O peso corporal de cada rato monitorizouse diariamente e todos os ratos foron sacrificados o 7º día.O duodeno collido (3 cm de lonxitude) foi cortado en anacos pequenos en 1 ml de PBS, os quistes destruíronse durante a noite en PBS a 4 °C e os trofozoítos de G. duodenalis.Illouse duodeno fresco (1 cm de lonxitude) para a tinción con hematoxilina e eosina (H&E).
Os ratos dividíronse en dous grupos: (i) grupo control MOCK e (ii) grupo inhibidor de MCC950.Houbo cinco tratamentos en cada grupo (n = 7/grupo de tratamento): (i) Grupo de control negativo de tratamento con PBS (só PBS; 100 µl/rato PBS, inxección intramuscular (IM) (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) grupo control negativo plásmido pcDNA3.1(+) (100 µg/ADN de rato, mediante inxección intramuscular) (iii) grupo control positivo de infección de quistes de G. duodenalis (1,5 x 106 quistes/rato, mediante sonda) (iv) a; grupo tratado con plásmido pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 μg/ADN de rato, mediante inxección intramuscular) e (v) un grupo tratado co plásmido pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 μg/rato). Despois de 12 horas de paso, os ratos do grupo inhibidor de MCC950 recibiron unha inxección intraperitoneal diaria de MCC950 (10 mg/kg de peso corporal) durante 7 días, mentres que os ratos do grupo MOCK recibiron un volume igual de tratamento con PBS. As mostras de sangue foron recollidos dos ratos dos globos oculares e deixados durante a noite a 4 °C. As mostras de soro foron illadas mediante un ensaio de inmunoabsorción ligado a encimas (ELISA) para e medicións dos niveis de IL-1β.
Trinta e cinco ratos dividíronse en cinco grupos (n=7/grupo).O grupo 1 foi un grupo control negativo tratado con PBS: os ratos recibiron 100 μl de PBS por vía intramuscular e 3 días despois por sonda.O grupo 2 é un grupo control positivo infectado con quistes de G. duodenalis: os ratos foron inxectados con 100 μl de PBS e 3 días despois inxectáronselle intragástricamente 1,5 x 106 quistes/rato.Terceiro grupo: inmunización plasmídica con pcDNA3.1(+) en combinación cun grupo control para a infección por quiste duodenal: os ratos recibiron 100 μg de ADN plasmídico pcDNA3.1(+)(im) por vía oral, 1,5×106 quistes/rato 3 durante varios días.Os grupos 4 e 5 foron o plásmido de giardina pcDNA3.1(+)-alfa-2 recombinante ou o plásmido de giardina pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 en combinación coa infección do quiste por G. duodenalis.Grupo experimental: os ratos recibiron 100 µg de pcDNA3.ADN plásmido de 1(+)-giardina (im), a continuación, 3 días despois, inxectáronse 1,5 × 106 quistes/rato mediante sonda.Monitorizouse o peso corporal de cada rato despois da introdución do quiste de G. duodenalis a través do tubo.Recolliuse duodeno fresco para medicións de carga parasitaria e análise de tinción con HE.
Os cambios histopatolóxicos analizáronse segundo un procedemento publicado previamente [30].Fixouse o duodeno fresco con fixador de células do tecido, incrustado en parafina, cortado en seccións de 4 μm, tinguiuse con H&E e analizouse ao microscopio óptico.Os cambios patolóxicos representativos en sete seccións de tecidos de sete ratos independentes foron avaliados por un patólogo que descoñecía o tratamento e capturáronse cun aumento de 200x.A lonxitude das vellosidades e a profundidade das criptas midéronse de acordo cos métodos descritos anteriormente.
Os resultados in vitro e in vivo obtivéronse por triplicado.Os gráficos foron xerados usando GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA).As diferenzas entre dous grupos analizáronse mediante a proba t, mentres que as diferenzas entre ≥3 grupos analizáronse mediante a análise unidireccional da varianza (ANOVA) mediante o software SPSS (versión 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, EUA).Os datos foron analizados para a homoxeneidade da varianza mediante a proba de Levene seguida da proba post hoc de Bonferroni (B).A significación exprésase como P<0,05, P<0,01 e P<0,001 (non significativo [ns]) (P>0,05).
A nosa análise anterior da proteómica do GEV na Enciclopedia de Xenos e xenomas de Kioto (KEGG) mostrou que moitos obxectivos poden estar implicados na activación das vías de sinalización inflamatoria [13].Seleccionamos dúas dianas prometedoras, giardinas alfa-2 e alfa-7.3, amplificamos estas moléculas e utilizámolas para construír o vector de expresión eucariota pcDNA3.1(+).Despois da secuenciación, transfectáronse plásmidos de expresión de giardina pcDNA3.1(+)-alfa-2 e alfa-7.3 recombinantes en macrófagos peritoneais primarios de rato, e identificouse a proteína de sinatura da inflamación caspase-1 p20 (un fragmento da caspase-1 activada). como dilucidar moléculas clave que poden desencadear inflamación.Os resultados mostraron que as giardinas alfa-2 e alfa-7.3 poden inducir a expresión da p20 caspase-1 similar á GEV.Non se atopou ningún efecto sobre a activación da caspase-1 no control negativo non tratado (só PBS) e no control do plásmido pcDNA3.1(+) (Figura 1).
Medición da activación da p20 caspase-1 por pcDNA3.1(+)-alfa-2 e alfa-7.3 giardinas.Os plásmidos de expresión eucariotas recombinantes pcDNA3.1(+)-alfa-2 e alfa-7.3 giardinas (enriba de cada pista) transfectáronse en macrófagos peritoneais primarios de rato e os sobrenadantes do cultivo recolléronse 24 horas despois.Utilizouse a transferencia Western para medir os niveis de expresión da proteína inflamasoma p20 caspase-1.O grupo de tratamento só con PBS (carril C) e o grupo de monoterapia pcDNA3.1(+) (carril pcDNA3.1) utilizáronse como control negativo e o grupo de tratamento con GEV como control positivo.A expresión da proteína recombinante foi confirmada detectando unha etiqueta de histidina en cada proteína, e as bandas proteicas esperadas eran alfa-2 giardine (38,2 kDa) e alfa-7,3 giardine (37,2 kDa).GEV, vesículas extracelulares de Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), vector linealizado EcoRV, SUP, sobrenadante
Para determinar se a giardina alfa-2 e a giardina alfa-7.3 inducen a expresión da p20 caspase-1 e desempeñan un papel na activación da resposta inflamatoria NLRP3 do hóspede, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine e pcDNA3.1(+)-alfa -7,3 giardina transfectouse en macrófagos peritoneais primarios de rato con ADN plasmídico recombinante, e determináronse os niveis de expresión, localización e oligomerización das proteínas inflamatorias clave NLRP3.Neste experimento, utilizouse GEV como grupo de control positivo e o grupo sen tratamento (só PBS) ou o grupo de tratamento de transfección pcDNA3.1(+) foi o grupo negativo.Os resultados mostraron que, como no grupo GEV, o ADN plásmido recombinante de giardin pcDNA3.1(+)-alfa-2 e giardin pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 deu lugar a unha regulación positiva de NLRP3, pro-IL-1β e activación da procaspase-1 e da caspase-1 (Fig. 2a).Ademais, ambas giardinas inducían unha secreción significativa de IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alfa-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;giardina alfa-7,3: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Figura 2b).A maioría das proteínas ASC eran monoméricas no grupo sen tratamento ou no grupo de tratamento transfectado co plásmido pcDNA3.1(+), en contraste con pcDNA3.1(+)-alfa-2 ou pcDNA3.1(+)-alfa- 7.3 giardina.A oligomerización ASC produciuse no ADN plasmídico recombinante do grupo ou grupo control positivo GEV, mostrando unha forma oligomérica (figura 2c).Estes datos preliminares suxiren que a giardina alfa-2 e a giardina alfa-7,3 poden inducir a activación da inflamación de NLRP3.Estudos inmunofluorescentes posteriores sobre a localización de ASC e NLRP3 mostraron que no grupo de control negativo, a proteína ASC estaba espallada polo citoplasma e apareceu como un sinal de punto tras a estimulación de pcDNA3.1(+)-alfa-2 con giardina ou pcDNA3.Grupo 1(+)-alfa-7,3 giardina ou grupo control positivo GEV (Figura 2d).No control negativo e os grupos pcDNA 3.1 tratados con plásmido, non se detectou o sinal da proteína NLRP3, mentres que un punto de sinal fluorescente en resposta á giardina pcDNA3.1(+)-alfa-2 ou pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 foi detectado..A giardina atópanse no citoplasma ou tras a estimulación do VHE (Fig. 2e).Estes datos demostran ademais que a giardina alfa-2 e a giardina alfa-7.3 de G. duodenalis activan o inflamasoma NLRP3 nos macrófagos peritoneais primarios de rato.
pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin e pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin activan o inflamasoma NLRP3 nos macrófagos peritoneais de rato.Transfectar os plásmidos de expresión eucariotas recombinantes pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin e pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin en macrófagos e células peritoneais primarias murinas, ou recoller o sobrenadante en 24 h para a análise da expresión, oligomerización. , secreción.e localización de proteínas inflamatorias clave.O grupo de só PBS (C) e o grupo de tratamento único pcDNA3.1(+) utilizáronse como control negativo e o grupo de tratamento con GEV como grupo positivo.a As proteínas inflamatorias clave NLRP3, incluíndo NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1 e p20 caspase-1, foron detectadas mediante transferencia Western.b Os niveis de secreción de IL-1β nos sobrenadantes determináronse mediante o ensaio de inmunoabsorción ligado a encimas (ELISA).Analizáronse as diferenzas entre os grupos de control e os experimentais mediante a análise unidireccional da varianza (ANOVA) utilizando o software SPSS versión 22.0.Os asteriscos indican diferenzas significativas entre os grupos **P<0,01 e ***P<0,001.c Os niveis de oligomerización de ASC nos gránulos determináronse mediante a análise de reticulación DSS, mentres que os niveis de ASC nos lisados ​​celulares utilizáronse como control de carga.d Visualización da localización ISC mediante inmunofluorescencia.e Utilizouse a inmunofluorescencia para visualizar a localización de NLRP3.ASC, proteína tipo mota apoptótica;IL, interleucina;NLRP3, receptor 3 semellante á oligomerización de unión a nucleótidos;ns, non significativo (P > 0,05)
Tanto G. duodenalis como os GEV que segrega activan o inflamasoma NLRP3 e regulan as respostas inflamatorias do hóspede in vitro.Así, o papel do inflamasoma NLRP3 na patoxenicidade de G. duodenalis segue sen estar claro.Para investigar este problema, deseñamos un experimento entre ratos infectados con quiste de G. duodenalis e ratos infectados con quiste de G. duodenalis + tratamento con inhibidor de MCC950 e comparou a expresión do inflamasoma NLRP3 cando se infectaba con quiste de G. duodenalis.Na figura 3a móstrase un esquema detallado do experimento.Os cambios no peso corporal dos ratos en diferentes grupos de tratamento foron monitorizados durante 7 días despois da infección con quistes, e os resultados móstranse na figura 3b.En comparación co grupo tratado con PBS puro, os resultados mostraron que (i) o peso corporal dos ratos infectados co quiste de G. duodenalis diminuíu do día 3 ao día 7 despois da infección;(ii) o tratamento co inhibidor MCC950 non tivo ningún efecto significativo sobre o peso corporal dos ratos..En comparación co grupo de infección única, o peso corporal do grupo de infección duodenal tratado con MCC950 diminuíu en diferentes graos (Día 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; Día 2: ANOVA, F(3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001; Día 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052, F (3, 24)=0,6497, P=0,0645; Día 6: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175; Día 7: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202;Estes datos demostran que o inflamasoma NLRP3 protexe aos ratos da perda de peso significativa nas fases iniciais (2-4 días) da infección duodenal.Despois pretendemos detectar trofozoítos de G. duodenalis no fluído de lavado duodenal e os resultados móstranse na figura 3c.En comparación co grupo de infección por quiste G. duodenalis, o número de trofozoítos no duodeno aumentou significativamente despois de bloquear o inflamasoma NLRP3 (t (12) = 2,902, P = 0,0133).Os tecidos duodenais tinguidos con HE mostraron, en comparación co control negativo tratado con PBS e MCC950 só: (i) A infección do quiste por G. duodenalis provocou danos nas vellosidades duodenais (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P=0,0488 ) e atrofia da cripta (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duodeno de ratos infectados con quistes de G. duodenalis e tratados con inhibidores de MCC950.Os vellosidades duodenais estaban danadas e mortas (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) con atrofia e ramificación da cripta (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d-). f) .Estes resultados suxiren que o inflamasoma NLRP3 xoga un papel na redución da patoxenicidade de G. duodenalis.
Papel do inflamasoma NLRP3 na infección por Giardia duodenum.Os ratos foron sometidos a sonda (iv) con quistes duodenocócicos e despois tratados con ou sen MCC950 (ip).Utilizáronse grupos de tratamento único con PBS ou MCC950 como controis.Grupo experimental e réxime de tratamento.b Controlouse o peso corporal dos ratos en cada un dos distintos grupos de tratamento durante 7 días.A diferenza entre o grupo de infección por G. duodenalis e o grupo de tratamento de infección por G. duodenalis + MCC950 analizouse mediante a proba t utilizando o software SPSS versión 22.0.Os asteriscos indican diferenzas significativas en *P<0,05, **P<0,01 ou ***P<0,001.c Determinouse a carga parasitaria contando o número de trofozoítos no fluído de lavado duodenal.A diferenza entre o grupo de infección por G. duodenalis e o grupo de tratamento de infección por G. duodenalis + MCC950 analizouse mediante a proba t utilizando o software SPSS versión 22.0.Os asteriscos indican diferenzas significativas en *P < 0,05.d Resultados da tinción de hematoxilina e eosina (H&E) da histopatoloxía duodenal.As frechas vermellas indican danos nas vellosidades, as verdes indican danos nas criptas.Barra de escala: 100 µm.e, f Análise estatística da altura da vellosidade duodenal e da altura da cripta do rato.Os asteriscos indican diferenzas significativas en *P<0,05 e **P<0,01.Os resultados son tomados de 7 experimentos biolóxicos independentes.BW, peso corporal;ig, vía de parto intragástrica;ip, vía de entrega intraperitoneal;ns, non significativo (P > 0,05);PBS, solución salina tamponada con fosfato;WT, tipo salvaxe
A secreción de IL-1β é un selo distintivo da activación da inflamación.Para determinar se a giardina alfa-2 e a giardina alfa-7.3 de G. duodenalis activan o inflamasoma do hóspede NLRP3 in vivo, utilizamos ratos WT non tratados (grupo simulado) e ratos bloqueados con inflamasoma NLRP3 (grupo de tratamento inhibido por MCC950).Na figura 4a móstrase un esquema detallado do experimento.Os grupos experimentais consistían en ratos tratados con PBS, tratamento de quistes de G. duodenalis mediante sonda, inxección intramuscular de pcDNA3.1 e inxección intramuscular de pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine ou pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.O 7º día despois da administración intramuscular do plásmido recombinante, recolliuse o soro e determinouse o nivel de IL-1β en cada grupo.Como se mostra na Figura 4b, no grupo MOCK: (i) en comparación co grupo PBS, o tratamento con pcDNA3.1 non tivo un efecto significativo na secreción de IL-1β (ANOVA, F (4.29) = 4.062, P = 0.9998), con todo, A secreción de IL-β foi significativamente elevada no grupo de quiste de G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) giardina pcDNA3.1-alfa-2 e pcDNA3.1- A inxección intramuscular de alfa-7,3 giardina aumentou significativamente os niveis séricos de IL-1β (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P <0,0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 giardine induciu altos niveis de secreción de IL -1β no grupo de inxección intramuscular de pcDNA3.1-alpha-2 giardine (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .En comparación con cada grupo do grupo de tratamento MCC950 e do grupo MOCK: (i) Os niveis de secreción de IL-1β no grupo control PBS e no grupo control pcDNA3.1 diminuíron ata certo punto despois de bloquear o inhibidor MCC950, pero a diferenza non foi. significativo (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3,1: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) despois de bloquear MCC950., a secreción de IL-1β reduciuse significativamente no grupo infectado con quiste de G. duodenalis, no grupo de giardina pcDNA3.1-alfa-2 e no grupo de giardina pcDNA3.1-alfa-7.3 (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3,540, P = 0,0120 pcDNA3,1-alfa-2 giardina: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447 pcDNA3,1-alfa-7,3 giardina: ANOVA, F(9, 58). ) = 3,540, P = 0,0164).Estes resultados suxiren que a giardina alfa-2 e a giardina alfa-7.3 median na activación do inflamasoma NLRP3 in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardinas activan o inflamasoma do hóspede NLRP3 in vivo.Os ratos foron inmunizados (IM) con plásmido de expresión eucariota recombinante pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine ou pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine e despois tratados con MCC950 (ip; grupo MCC950) ou non (grupo ficticio). ).Utilizouse o grupo de tratamento con plásmidos PBS ou pcDNA3.1(+) como control negativo, o grupo de tratamento con quiste de G. duodenalis como control positivo.Grupo experimental e réxime de tratamento.b Os niveis séricos de IL-1β en ratos foron medidos o día 7 mediante un ensaio ELISA.Analizáronse as diferenzas entre os grupos do grupo MOCK mediante ANOVA unidireccional e as diferenzas entre o grupo MOCK e o grupo MCC950 mediante a proba t do software SPSS versión 22.0.Os asteriscos indican diferenzas significativas entre os grupos de tratamento no grupo MOCK, *P<0,05 e ***P<0,001;os signos de dólar ($) indican diferenzas significativas entre cada grupo do grupo MOCK e do grupo MCC950 en P<0,05.Resultados de sete experimentos biolóxicos independentes.i, inxección intramuscular, ns, non significativa (P > 0,05)
Para investigar o efecto da activación mediada por alfa-2 e alfa-7.3 giardina do inflamasoma do hóspede NLRP3 sobre a infecciosidade de G. duodenalis, utilizamos ratos WT C57BL/6 e inxectamos alfa-2 giardine e alfa-7.3 giardine.o plásmido inxectouse por vía intramuscular, despois de 3 días a través do tubo gástrico do quiste de G. duodenalis, despois do cal os ratos foron observados durante 7 días.Na figura 5a móstrase un esquema detallado do experimento.O peso corporal de cada rato mediuse todos os días, recolléronse mostras de tecido duodenal fresco o 7º día despois da administración a través dunha sonda gástrica, mediuse o número de trofozoítos e observáronse cambios histopatolóxicos.Como se mostra na Figura 5b, co aumento do tempo de alimentación, o peso corporal dos ratos de cada grupo aumentou gradualmente.O MT dos ratos comezou a diminuír o terceiro día despois da administración intragástrica de quistes de G. duodenalis, e despois aumentou gradualmente.A activación do inflamasoma NLRP3 inducida pola inxección intramuscular de alfa-2 giardine e alfa-7.3 giardine atenuou significativamente a perda de peso en ratos (Día 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0,9754 Día 1: giardina pcDNA3.1-alfa-7.3, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 Día 2: giardina pcDNA3.1-alfa-2, ANOVA, F( 4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; Día 2: pcDNA3,1-alfa-7,3 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409: pcDNA3,1-alfa-2 giardine, ANOVA; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Día 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0,8222, P = 0,0083 Día 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Día 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P <0,0001, Día 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Día 5: pcDNA3,1-alfa -7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Día 6: pcDNA3 ,1 - alfa-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, Día 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Día 7: giardina pcDNA3.1-alfa-2, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Día 7: giardina pcDNA3.1-alfa-7,3, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Valorouse a carga parasitaria no duodeno (Fig. 5c).En comparación co control positivo non tratado e o grupo ao que se inxectou o vector pcDNA3.1 baleiro, o número de trofozoítos de G. duodenalis reduciuse significativamente nos grupos aos que se inxectou α-2 giardina e α-7,3 giardina (pcDNA3.1-alpha). -2 giardina: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alfa-7,3 giardina: ANOVA, F (3, 24) = 1,209, P <0,0001).Ademais, a giardina alfa-7.3 foi máis protectora nos ratos que a giardina alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081).Os resultados da tinción con HE móstranse na fig.5d-f.Os ratos aos que se lles inxectaba giardina alfa-2 e giardina alfa-7.3 presentaban menos lesións no tecido duodenal, manifestadas por danos nas vellosidades, en comparación cos ratos aos que se lles inxectaba G. duodenalis e os ratos aos que se lles inxectaba G. duodenalis en combinación cun vector pcDNA3 baleiro .1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2 giardina: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 ou P = 0,0068; pcDNA3.1-alfa-7,3 giardina: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 ou P = 0,0055) e redución da atrofia da cripta (pcDNA3.1-alfa-2 giardina: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 ou P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 ou P = 0,0191).Estes resultados suxiren que a giardina alfa-2 e a giardina alfa-7,3 reducen a infectividade de G. duodenalis ao activar o inflamasoma NLRP3 in vivo.
Papel de pcDNA3.1(+)-giardinas na infección por G. duodenalis.Os ratos foron inmunizados (IM) con plásmidos de expresión eucariotas recombinantes pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine ou pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine e despois desafiáronse con quistes de G. duodenalis (ig).O grupo PBS e o grupo de tratamento de quiste duodenal pcDNA3.1(+) + utilizáronse como grupos de control negativo e o grupo de tratamento de quiste duodenal utilizouse como grupo de control positivo.Grupo experimental e réxime de tratamento.b Monitorizouse a MT dos ratos en cada un dos distintos grupos de tratamento durante 7 días despois do desafío.Os asteriscos indican diferenzas significativas entre os grupos do grupo G. duodenalis e do grupo pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine, *P <0,05, **P <0,01 e ***P <0,001;o signo de dólar ($) indica unha diferenza significativa entre cada grupo de G. duodenalis e o grupo pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine, $$P<0,01 e $$$P<0,001.c Determinouse a carga parasitaria contando o número de trofozoítos en 1 ml de lavado duodenal do duodeno (3 cm de lonxitude) e expresouse como o número de parasitos por cm de duodeno.Analizáronse as diferenzas entre o grupo de infección por G. duodenalis, o grupo de giardina pcDNA3.1(+)-alfa-2 e o grupo de giardina pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 mediante ANOVA unidireccional utilizando a versión 22.0 do software SPSS.Os asteriscos indican diferenzas significativas en **P<0,01 e ***P<0,001.d Cambios histopatolóxicos no duodeno.As frechas vermellas indican danos nas vellosidades, as verdes indican danos nas criptas.Barra de escala: 100 µm.e, f Análise estatística da altura da vellosidade duodenal do rato (e) e da altura da cripta (f).As diferenzas entre os grupos na Figura 1d foron analizadas mediante ANOVA unidireccional usando o software SPSS versión 22.0.Os asteriscos indican diferenzas significativas en *P<0,05 e **P<0,01.Resultados de sete experimentos biolóxicos independentes.ns, non significativo (P > 0,05)
Giardia duodenum é un coñecido parasito intestinal de humanos e outros mamíferos que causa a xiardíase.En 2004, incluíuse na Iniciativa de Enfermidades Desatendidas da OMS debido á súa alta prevalencia durante 6 anos, especialmente en comunidades de baixo nivel socioeconómico [32].O sistema inmunitario innato xoga un papel fundamental na resposta inmune á infección por G. duodenalis.Informes que os macrófagos dos ratos engulian e matan G. duodenalis liberando trampas extracelulares [33].Os nosos estudos anteriores demostraron que G. duodenalis, un parasito extracelular non invasivo, activa as vías de sinalización inflamatoria p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 e NLRP3 nos macrófagos de rato para regular as respostas inflamatorias do hóspede, e o GEV liberado pode mellorar este proceso.13], 24].Non obstante, aínda quedan por dilucidar os PAMP exactos implicados na inflamación regulada polo inflamasoma NLRP3 en GEV e o papel do inflamasoma NLRP3 na xiardíase.Para arroxar luz sobre estas dúas preguntas, realizamos este estudo.
O inflamasoma NLRP3 está situado no citoplasma das células inmunes e pode ser activado por varias partículas como cristais de ácido úrico, toxinas, bacterias, virus e parasitos.En estudos bacterianos, identificáronse toxinas como PAMP clave que activan sensores inflamatorios, o que provoca inflamación e morte celular [34].Algunhas toxinas estruturalmente diversas, como a hemolisina de Staphylococcus aureus [35] e Escherichia coli [36], a hemolisina BL (HBL) da enterotoxina (NHE) [37], inducen a activación da inflamación de NLRP3.Estudos virais demostraron que as proteínas de virulencia como a proteína da envoltura (E) do SARS-COV-2 [38] e a proteína NS5 do virus Zika [39] son ​​PAMP importantes recoñecidos polo receptor NLRP3.En estudos sobre parasitos, informouse de que moitos parasitos están asociados coa activación do inflamasoma do hóspede, como Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] e Leishmania [42].As proteínas de gránulos densos GRA35, GRA42 e GRA43, asociadas á virulencia de Toxoplasma gondii, son necesarias para a indución da piroptose nos macrófagos de ratas de Lewis [43].Ademais, algúns estudos de Leishmania centráronse en moléculas individuais implicadas no inflamasoma NLRP3, como o lipofosfoglicano de membrana do parasito [44] ou a metaloprotease de cinc [45].Entre a familia de xenes das alfa-giardinas semellantes ás anexinas, demostrouse que a alfa-1 giardina é un candidato potencial á vacina que proporciona protección contra G. duodenalis nun modelo de rato [18].No noso estudo, seleccionamos os factores de virulencia de G. duodenalis alfa-2 e alfa-7,3 giardinas, que son exclusivos de giardia pero relativamente menos informados.Estes dous xenes diana clonáronse no vector do sistema de expresión eucariota pcDNA3.1(+) para a análise da activación da inflamación.
No noso modelo de rato, os fragmentos de caspase clivados serven como marcadores de activación inflamatoria.Tras a estimulación, NLRP3 interactúa con ASC, recruta procaspases e xera caspases activas que escinden pro-IL-1β e pro-IL-18 en IL-1β e IL-18 maduras, respectivamente -18.As caspases inflamatorias (caspases-1, -4, -5 e -11) son unha familia conservada de cisteína proteases que son críticas para a defensa innata e están implicadas na inflamación e na morte celular programada [46].A caspase-1 é activada polos inflamasomas canónicos [47], mentres que as caspasas-4, -5 e -11 son escindidas durante a formación de inflamasomas atípicos [48].Neste estudo, utilizamos macrófagos peritoneais de rato como modelo e investigamos a caspase-1 escindida por p20 caspase-1 como un marcador da activación da inflamación NLRP3 do hóspede en estudos sobre a infección por G. duodenalis.Os resultados mostraron que moitas alfa-giardinas son responsables da activación típica da inflamación, o que é consistente co descubrimento de moléculas de virulencia clave implicadas en bacterias e virus.Non obstante, o noso estudo é só unha pantalla preliminar e hai outras moléculas que poden activar inflamasomas non clásicos, xa que o noso estudo anterior atopou inflamasomas tanto clásicos como non clásicos na infección por G. duodenalis [13].Para determinar aínda máis se a p20 caspase-1 xerada está asociada co inflamasoma NLRP3, transfectamos giardinas alfa-2 e alfa-7.3 en macrófagos peritoneais de rato para determinar os niveis de expresión de proteínas da molécula clave e os niveis de oligomerización ASC, confirmando que ambas as dúas α-giardinas se activan. inflamasoma NLRP3.Os nosos resultados son lixeiramente diferentes dos de Manko-Prykhoda et al., que informaron de que a estimulación das células Caco-2 con cepas EPEC de G. muris ou E. coli só pode aumentar a intensidade de fluorescencia de NLRP3, ASC e caspase-1, aínda que non de forma significativa, mentres que a coestimulación de G. muris e E. coli aumentou os niveis de tres proteínas [49].Esta discrepancia pode deberse a diferenzas na selección de especies de Giardia, liñas celulares e células primarias.Tamén realizamos ensaios in vivo usando MCC950 en ratos WT C57BL/6 femias de 5 semanas de idade, que son máis susceptibles a G. duodenalis.MCC950 é un potente e selectivo inhibidor de NLRP3 de pequenas moléculas que bloquea a activación canónica e non canónica de NLRP3 a concentracións nanomolares.MCC950 inhibe a activación de NLRP3 pero non afecta a activación das vías inflamatorias AIM2, NLRC4 e NLRP1 nin das vías de sinalización TLR [27].O MCC950 bloquea a activación de NLRP3 pero non inhibe a iniciación de NLRP3, a saída de K+, a entrada de Ca2+ nin a interacción entre NLRP3 e ASC;en cambio, inhibe a activación do inflamasoma NLRP3 bloqueando a oligomerización de ASC [27].Polo tanto, utilizamos MCC950 nun estudo in vivo para determinar o papel do inflamasoma NLRP3 despois da inxección de giardina.A caspase-1 p10 activada escinde as citocinas pro-inflamatorias pro-IL-1β e pro-IL-18 en IL-1β e IL-18 maduras [50].Neste estudo, os niveis séricos de IL-1β en ratos tratados con xiardina con ou sen MCC950 utilizáronse como indicador de se o inflamasoma NLRP3 estaba activado.Como era de esperar, o tratamento con MCC950 reduciu significativamente os niveis séricos de IL-1β.Estes datos demostran claramente que G. duodenalis giardin alfa-2 e giardin alfa-7.3 son capaces de activar o inflamasoma do rato NLRP3.
Os datos significativos acumulados durante a última década demostraron que a IL-17A é o principal regulador da inmunidade contra G. muris, induce a sinalización de IL-17RA, produce péptidos antimicrobianos e regula a activación do complemento [51].Non obstante, a infección por Giardia ocorre con máis frecuencia en adultos novos, e informouse de que a infección por Giardia en ratos novos non activa a resposta IL-17A para exercer o seu efecto protector [52], o que fixo que os investigadores busquen outra Giardia inmunomoduladora.mecanismos de infección por helmintos.Os autores dun estudo recente informaron de que G. muris pode activar o inflamasoma NLRP3 por E. coli EPEC, que promove a produción de péptidos antimicrobianos e reduce a súa capacidade de unión e o número de trofozoítos no tracto intestinal, reducindo así a gravidade do colon. enfermidades causadas por bacilos [49].O inflamasoma NLRP3 está implicado no desenvolvemento de varias enfermidades.Os estudos demostraron que Pseudomonas aeruginosa desencadea a autofaxia nos macrófagos para evitar a morte celular, e este proceso depende da activación do inflamasoma NLRP3 [53].Para N. caninum, a activación do inflamasoma NLRP3 mediada por especies reactivas de osíxeno limita a súa replicación no hóspede, converténdoo nunha diana terapéutica potencial [9].Descubriuse que Paracoccidioides brasiliensis induce a activación do inflamasoma NLRP3 nas células dendríticas derivadas da medula ósea do rato, o que resulta na liberación da citocina inflamatoria IL-1β, que xoga un papel crítico na defensa do hóspede [10].Varias especies de Leishmania, incluíndo L. amazonensis, L. major, L. braziliensis e L. infantum chagasi, activan a NLRP3 e a caspase-1 dependente de ASC nos macrófagos, así como a infección por Leishmania.A replicación do parasito realízase nos ratos deficientes no xene NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Zamboni et al.A infección por Leishmania induce a activación do inflamasoma NLRP3 nos macrófagos, o que limita a replicación intracelular do parasito.Así, a Leishmania pode inhibir a activación de NLRP3 como estratexia de evitación.En estudos in vivo, o inflamasoma NLRP3 contribuíu á eliminación de Leishmania, pero non afectou aos tecidos [54].Pola contra, nos estudos sobre helmintiasis, a activación do inflamasoma NLRP3 suprimiu a inmunidade protectora do hóspede contra a helmintiase gastrointestinal [12].Shigella é unha das principais bacterias que causan diarrea en todo o mundo.Estas bacterias poden inducir a produción de IL-1β a través do efluxo de K+ mediado polo receptor P2X7, especies reactivas do osíxeno, acidificación lisosomal e dano mitocondrial.O inflamasoma NLRP3 regula negativamente a fagocitose e a actividade bactericida dos macrófagos contra Shigella [55].Os estudos de Plasmodium demostraron que os ratos deficientes en AIM2, NLRP3 ou caspase-1 infectados con Plasmodium producen altos niveis de interferón tipo 1 e son máis resistentes á infección por Plasmodium [56].Non obstante, non está claro o papel da giardina alfa-2 e da giardina alfa-7.3 na indución da activación patóxena da inflamación de NLRP3 en ratos.
Neste estudo, a inhibición do inflamasoma NLRP3 por MCC950 reduciu o peso corporal e aumentou o número de trofozoítos no fluído de lavado intestinal en ratos, o que provocou cambios patolóxicos máis graves no tecido duodenal.A giardina alfa-2 e a giardina alfa-7.3 activan o inflamasoma NLRP3 do rato hóspede, aumentan o peso corporal do rato, reducen o número de trofozoítos no líquido de lavado intestinal e alivian as lesións duodenais patolóxicas.Estes resultados suxiren que G. duodenalis pode activar o inflamasoma do hóspede NLRP3 mediante a giardina alfa-2 e a giardina alfa-7,3, reducindo a patoxenicidade de G. duodenalis nos ratos.
En conxunto, os nosos resultados demostran que as giardinas alfa-2 e alfa-7.3 inducen a activación do inflamasoma do hóspede NLRP3 e reducen a infecciosidade de G. duodenalis en ratos.Polo tanto, estas moléculas son obxectivos prometedores para a prevención da xiardíase.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiase: unha visión xeral.Revelouse recentemente que Pat Inflamm é alérxico ás drogas.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: unha revisión da farmacoterapia.Opinión pericial dun farmacéutico.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiase, resistencia a medicamentos e descubrimento de novos obxectivos.Infects Disorden obxectivos de drogas.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, etc. NLRP3 inflamasomas e enfermidades inflamatorias.Óxido Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. O papel do inflamasoma na inflamación intestinal e no cancro.Gastroenteroloxía.2011;141: 1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Activación canónica e atípica do inflamasoma NLRP3 na encrucillada da tolerancia inmune e a inflamación intestinal.preinmune.2017; 8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.A activación do inflamasoma NLRP3 mediada por ROS está implicada en resposta á infección por N. caninum.Vector parasito.2020;13:449.