Grazas por visitar Nature.com.A versión do navegador que estás a usar ten soporte CSS limitado.Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, renderizaremos o sitio sen estilos e JavaScript.
Os vectores xenéticos para o tratamento da fibrose quística pulmonar deben estar dirixidos ás vías aéreas condutoras, xa que a transdución pulmonar periférica non ten efecto terapéutico.A eficiencia da transdución viral está directamente relacionada co tempo de residencia do portador.Non obstante, os fluídos de liberación, como os portadores de xenes, difunden naturalmente nos alvéolos durante a inhalación, e as partículas terapéuticas de calquera forma son eliminadas rapidamente mediante o transporte mucociliar.Estender o tempo de residencia dos portadores de xenes no tracto respiratorio é importante pero difícil de conseguir.As partículas magnéticas conxugadas ao portador que poden dirixirse á superficie do tracto respiratorio poden mellorar a orientación rexional.Debido a problemas coas imaxes in vivo, o comportamento destas pequenas partículas magnéticas na superficie das vías aéreas en presenza dun campo magnético aplicado é pouco entendido.O obxectivo deste estudo foi utilizar imaxes de sincrotrón para visualizar in vivo o movemento dunha serie de partículas magnéticas na tráquea de ratas anestesiadas co fin de estudar in vivo a dinámica e os patróns de comportamento de partículas simples e a granel.A continuación, tamén avaliamos se a entrega de partículas magnéticas lentivirais en presenza dun campo magnético aumentaría a eficiencia da transdución na tráquea da rata.As imaxes de raios X de sincrotrón mostran o comportamento das partículas magnéticas en campos magnéticos estacionarios e en movemento in vitro e in vivo.As partículas non se poden arrastrar facilmente pola superficie das vías aéreas vivas usando imáns, pero durante o transporte, os depósitos concéntranse no campo de visión, onde o campo magnético é máis forte.A eficiencia da transdución tamén se multiplicou por seis cando as partículas magnéticas lentivirais foron entregadas en presenza dun campo magnético.En conxunto, estes resultados suxiren que as partículas magnéticas lentivirais e os campos magnéticos poden ser enfoques valiosos para mellorar a orientación dos vectores xenéticos e os niveis de transdución nas vías aéreas condutoras in vivo.
A fibrose quística (FC) é causada por variacións nun único xene chamado regulador de condutancia transmembrana de CF (CFTR).A proteína CFTR é unha canle iónica que está presente en moitas células epiteliais de todo o corpo, incluídas as vías respiratorias, un lugar importante na patoxénese da fibrose quística.Os defectos no CFTR levan a un transporte de auga anormal, a deshidratación da superficie das vías aéreas e a diminución da profundidade da capa de fluído da superficie das vías aéreas (ASL).Tamén prexudica a capacidade do sistema de transporte mucociliar (MCT) de limpar as vías respiratorias de partículas e patóxenos inhalados.O noso obxectivo é desenvolver unha terapia xénica lentiviral (LV) para entregar a copia correcta do xene CFTR e mellorar ASL, MCT e a saúde pulmonar, e seguir desenvolvendo novas tecnoloxías que poidan medir estes parámetros in vivo1.
Os vectores LV son un dos principais candidatos para a terapia xénica da fibrose quística, principalmente porque poden integrar permanentemente o xene terapéutico nas células basais das vías respiratorias (células nai das vías respiratorias).Isto é importante porque poden restaurar a hidratación normal e a eliminación do moco diferenciándose en células funcionais da superficie das vías respiratorias correxidas por xenes asociadas á fibrose quística, o que resulta en beneficios para toda a vida.Os vectores LV deben dirixirse contra as vías aéreas condutoras, xa que é aquí onde comeza a afectación pulmonar na FQ.A entrega do vector máis profundamente no pulmón pode producir unha transdución alveolar, pero isto non ten ningún efecto terapéutico na fibrose quística.Non obstante, os fluídos como os portadores de xenes migran naturalmente aos alvéolos cando se inhalan despois do parto3,4 e as partículas terapéuticas son expulsadas rapidamente á cavidade oral polos MCT.A eficiencia da transdución do ventrículo izquierdo está directamente relacionada co período de tempo que o vector permanece preto das células diana para permitir a captación celular - "tempo de residencia" 5 que se acurta facilmente polo fluxo de aire rexional típico, así como pola captación coordinada de moco e partículas de MCT.Para a fibrose quística, a capacidade de prolongar o tempo de permanencia do VI nas vías respiratorias é importante para acadar altos niveis de transdución nesta área, pero ata agora foi un reto.
Para superar este obstáculo, propoñemos que as partículas magnéticas de LV (MP) poden axudar de dúas formas complementarias.En primeiro lugar, poden ser guiados por un imán á superficie da vía aérea para mellorar a orientación e axudar ás partículas portadoras de xenes a estar na zona correcta da vía aérea;e ASL) móvense á capa celular 6. Os MP úsanse amplamente como vehículos de administración de fármacos dirixidos cando se unen a anticorpos, fármacos de quimioterapia ou outras moléculas pequenas que se unen ás membranas celulares ou se unen aos seus respectivos receptores da superficie celular e acumúlanse nos sitios do tumor. presenza de electricidade estática.Campos magnéticos para a terapia do cancro 7. Outros métodos "hipertérmicos" están dirixidos a matar as células tumorais quentando os MP cando se exponen a campos magnéticos oscilantes.O principio de transfección magnética, no que se usa un campo magnético como axente de transfección para mellorar a transferencia de ADN ás células, utilízase habitualmente in vitro usando unha serie de vectores xenéticos non víricos e virais para liñas celulares difíciles de transducir. ..Estableceuse a eficiencia da magnetotransfección LV coa entrega de MP LV in vitro nunha liña celular de epitelio bronquial humano en presenza dun campo magnético estático, aumentando a eficiencia da transdución en 186 veces en comparación co vector LV só.LV MT tamén se aplicou a un modelo in vitro de fibrose quística, onde a transfección magnética aumentou a transdución do ventrículo izquierdo en cultivos de interface aire-líquido nun factor 20 en presenza de esputo de fibrose quística10.Non obstante, a magnetotransfección de órganos in vivo recibiu relativamente pouca atención e só se avaliou en poucos estudos en animais11,12,13,14,15, especialmente nos pulmóns16,17.Non obstante, as posibilidades de transfección magnética na terapia pulmonar na fibrose quística son claras.Tan et al.(2020) afirmou que "un estudo de validación sobre a entrega pulmonar eficaz de nanopartículas magnéticas allanará o camiño para futuras estratexias de inhalación de CFTR para mellorar os resultados clínicos en pacientes con fibrose quística"6.
O comportamento das pequenas partículas magnéticas na superficie do tracto respiratorio en presenza dun campo magnético aplicado é difícil de visualizar e estudar, polo que non se entenden mal.Noutros estudos, desenvolvemos un método de imaxe de raios X de contraste de fase (PB-PCXI) baseado na propagación de sincrotrón para a obtención de imaxes non invasivas e a cuantificación de diminutos cambios in vivo na profundidade de ASL18 e no comportamento do MCT19,20 para medir directamente a hidratación da superficie da canle de gas. e úsase como un indicador precoz da eficacia do tratamento.Ademais, o noso método de puntuación MCT utiliza partículas de 10-35 µm de diámetro compostas de alúmina ou vidro de alto índice de refracción como marcadores MCT visibles con PB-PCXI21.Ambos métodos son axeitados para obter imaxes de varios tipos de partículas, incluíndo MP.
Debido á alta resolución espacial e temporal, os nosos ensaios ASL e MCT baseados en PB-PCXI son moi axeitados para estudar a dinámica e os patróns de comportamento de partículas únicas e a granel in vivo para axudarnos a comprender e optimizar os métodos de entrega de xenes MP.O enfoque que usamos aquí baséase nos nosos estudos utilizando a liña de luz SPring-8 BL20B2, na que visualizamos o movemento do fluído despois da entrega dunha dose dun vector ficticio nas vías respiratorias nasais e pulmonares dos ratos para axudar a explicar os nosos patróns heteroxéneos de expresión xénica observados. no noso xene.estudos en animais cunha dose de portador de 3,4.
O obxectivo deste estudo foi utilizar o sincrotrón PB-PCXI para visualizar os movementos in vivo dunha serie de MP na tráquea de ratas vivas.Estes estudos de imaxe PB-PCXI foron deseñados para probar a serie MP, a intensidade do campo magnético e a localización para determinar o seu efecto no movemento MP.Supoñemos que un campo magnético externo axudaría ao MF entregado a permanecer ou moverse cara á zona de destino.Estes estudos tamén nos permitiron determinar configuracións de imáns que maximizan a cantidade de partículas que quedan na tráquea despois da deposición.Nunha segunda serie de estudos, pretendemos utilizar esta configuración óptima para demostrar o patrón de transdución resultante da entrega in vivo de LV-MP ás vías respiratorias das ratas, asumindo que a entrega de LV-MPs no contexto da orientación das vías aéreas resultaría. en aumento da eficiencia de transdución LV..
Todos os estudos en animais realizáronse de acordo cos protocolos aprobados pola Universidade de Adelaida (M-2019-060 e M-2020-022) e o Comité de Ética Animal de Sincrotrón SPring-8.Os experimentos realizáronse de acordo coas recomendacións de ARRIVE.
Todas as imaxes de raios X foron tomadas na liña de luz BL20XU no sincrotrón SPring-8 en Xapón usando unha configuración similar á descrita anteriormente21,22.Brevemente, a caixa experimental situouse a 245 m do anel de almacenamento do sincrotrón.Para os estudos de imaxe de partículas utilízase unha distancia de mostra ao detector de 0,6 m e de 0,3 m para estudos de imaxe in vivo para crear efectos de contraste de fase.Utilizouse un feixe monocromático cunha enerxía de 25 keV.As imaxes foron adquiridas mediante un transdutor de raios X de alta resolución (SPring-8 BM3) acoplado a un detector sCMOS.O transdutor converte os raios X en luz visible usando un centelleador de 10 µm de espesor (Gd3Al2Ga3O12), que despois se dirixe ao sensor sCMOS mediante un obxectivo de microscopio ×10 (NA 0,3).O detector sCMOS era un Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Xapón) cun tamaño de matriz de 2048 × 2048 píxeles e un tamaño de píxeles brutos de 6,5 × 6,5 µm.Esta configuración proporciona un tamaño de píxel isotrópico efectivo de 0,51 µm e un campo de visión de aproximadamente 1,1 mm × 1,1 mm.Elixiuse a duración da exposición de 100 ms para maximizar a relación sinal-ruído das partículas magnéticas dentro e fóra das vías respiratorias ao tempo que se minimizan os artefactos de movemento causados ​​pola respiración.Para os estudos in vivo, colocouse un obturador de raios X rápido na ruta dos raios X para limitar a dose de radiación bloqueando o feixe de raios X entre exposicións.
Os medios LV non se utilizaron en ningún estudo de imaxe SPring-8 PB-PCXI porque a cámara de imaxe BL20XU non ten a certificación de nivel 2 de bioseguridade.Pola contra, seleccionamos unha serie de MPs ben caracterizados de dous vendedores comerciais que abarcan unha variedade de tamaños, materiais, concentracións de ferro e aplicacións, primeiro para comprender como os campos magnéticos afectan o movemento dos MPs nos capilares de vidro e despois vías respiratorias vivas.superficie.O tamaño do MP varía de 0,25 a 18 µm e está feito de varios materiais (ver a táboa 1), pero descoñécese a composición de cada mostra, incluíndo o tamaño das partículas magnéticas do MP.Baseándonos nos nosos extensos estudos de MCT 19, 20, 21, 23, 24, esperamos que se poidan ver MP de ata 5 µm na superficie da vía aérea traqueal, por exemplo, restando cadros consecutivos para ver unha mellor visibilidade do movemento MP.Un só MP de 0,25 µm é menor que a resolución do dispositivo de imaxe, pero espérase que PB-PCXI detecte o seu contraste volumétrico e o movemento do líquido superficial no que se depositan despois de ser depositados.
Mostras para cada MP da táboa.1 preparouse en capilares de vidro de 20 μl (Drummond Microcaps, PA, EUA) cun diámetro interno de 0,63 mm.As partículas corpusculares están dispoñibles en auga, mentres que as partículas CombiMag están dispoñibles no líquido patentado do fabricante.Cada tubo énchese á metade de líquido (aproximadamente 11 µl) e colócase no soporte da mostra (consulte a Figura 1).Os capilares de vidro colocáronse horizontalmente no escenario na cámara de imaxe, respectivamente, e colocáronse nos bordos do líquido.Un imán de níquel de 19 mm de diámetro (28 mm de lonxitude) feito de terras raras, neodimio, ferro e boro (NdFeB) (N35, nº de cat. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) cunha remanencia de 1,17 T foi unido a un táboa de transferencia separada para lograr Cambiar remotamente a súa posición durante a representación.As imaxes de raios X comezan cando o imán está situado aproximadamente 30 mm por riba da mostra e as imaxes adquírense a 4 cadros por segundo.Durante a imaxe, o imán achegouse ao tubo capilar de vidro (a unha distancia de aproximadamente 1 mm) e despois moveuse ao longo do tubo para avaliar o efecto da intensidade do campo e da posición.
Unha configuración de imaxe in vitro que contén mostras de MP en capilares de vidro na fase de tradución da mostra xy.O camiño do feixe de raios X está marcado cunha liña de puntos vermellas.
Unha vez establecida a visibilidade in vitro dos MP, probouse un subconxunto deles in vivo en ratas albinas Wistar femias de tipo salvaxe (~12 semanas de idade, ~200 g).Medetomidina 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Xapón), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Xapón) e butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).As ratas foron anestesiadas con mestura Pharma (Xapón) mediante inxección intraperitoneal.Despois da anestesia, preparáronse para a obtención de imaxes eliminando o pelaje ao redor da tráquea, introducindo un tubo endotraqueal (ET; cánula intravenosa de 16 Ga, Terumo BCT) e inmobilizándoos en posición supina nunha placa de imaxe feita a medida que contén unha bolsa térmica. para manter a temperatura corporal.22. A placa de imaxe foi entón unida á fase de mostra na caixa de imaxe cun lixeiro ángulo para aliñar a tráquea horizontalmente na imaxe de raios X como se mostra na figura 2a.
(a) Configuración de imaxes in vivo na unidade de imaxe SPring-8, camiño do feixe de raios X marcado cunha liña de puntos vermellas.(b, c) A localización do imán traqueal realizouse de forma remota usando dúas cámaras IP montadas ortogonalmente.No lado esquerdo da imaxe na pantalla, podes ver o bucle de arame que suxeita a cabeza e a cánula de entrega instalada dentro do tubo ET.
Un sistema de bomba de xeringa controlado a distancia (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) que utiliza unha xeringa de vidro de 100 µl foi conectado a un tubo PE10 (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) usando unha agulla de 30 Ga.Marque o tubo para asegurarse de que a punta está na posición correcta na tráquea ao inserir o tubo endotraqueal.Usando unha microbomba, retirouse o émbolo da xiringa e mergullouse a punta do tubo na mostra de MP que se debía entregar.Despois inseriuse o tubo de entrega cargado no tubo endotraqueal, colocando a punta na parte máis forte do noso campo magnético aplicado esperado.A adquisición de imaxes controlouse mediante un detector de alento conectado á nosa caixa de temporización baseada en Arduino, e todos os sinais (por exemplo, temperatura, respiración, apertura/pechadura do obturador e adquisición de imaxes) foron rexistrados usando Powerlab e LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia). Cando a carcasa non estaba dispoñible, colocáronse dúas cámaras IP (Panasonic BB-SC382) a aproximadamente 90 ° entre si e utilizáronse para controlar a posición do imán en relación á tráquea durante a imaxe (Figura 2b, c).Para minimizar os artefactos de movemento, adquiriuse unha imaxe por respiración durante a meseta do fluxo respiratorio terminal.
O imán está unido á segunda etapa, que pode estar situada remotamente no exterior do corpo de imaxe.Probáronse varias posicións e configuracións do imán, incluíndo: colocado nun ángulo de aproximadamente 30° sobre a tráquea (as configuracións móstranse nas figuras 2a e 3a);un imán enriba do animal e outro abaixo, cos polos postos para a atracción (Figura 3b)., un imán enriba do animal e outro abaixo, cos polos postos para a repulsión (Figura 3c), e un imán arriba e perpendicular á tráquea (Figura 3d).Despois de configurar o animal e o imán e cargar o MP en proba na bomba de xiringa, administre unha dose de 50 µl a unha velocidade de 4 µl/seg despois da adquisición das imaxes.Despois, o imán móvese cara atrás e cara atrás ao longo ou a través da tráquea mentres continúa adquirindo imaxes.
Configuración de imán para imaxes in vivo (a) un imán por riba da tráquea nun ángulo de aproximadamente 30°, (b) dous imáns configurados para atracción, (c) dous imáns configurados para repulsión, (d) un imán por riba e perpendicular á traquea.O observador mirou desde a boca ata os pulmóns a través da tráquea e o feixe de raios X atravesou o lado esquerdo da rata e saíu polo lado dereito.O imán móvese ao longo da vía aérea ou á esquerda e á dereita por riba da tráquea na dirección do feixe de raios X.
Tamén se buscou determinar a visibilidade e o comportamento das partículas nas vías respiratorias en ausencia de mestura de respiración e frecuencia cardíaca.Polo tanto, ao final do período de imaxe, os animais foron sacrificados humanamente debido a unha sobredose de pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, EUA; ~65 mg/kg ip).Algúns animais quedaron na plataforma de imaxe e, despois do cese da respiración e do latido cardíaco, repetiuse o proceso de imaxe, engadindo unha dose adicional de MP se non era visible ningún MP na superficie das vías respiratorias.
As imaxes resultantes corrixíronse para o campo plano e escuro e logo ensamblaron nunha película (20 fotogramas por segundo; 15–25 × velocidade normal dependendo da frecuencia respiratoria) mediante un script personalizado escrito en MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Todos os estudos sobre a entrega de vectores xenéticos LV realizáronse no Centro de Investigación Animal de Laboratorio da Universidade de Adelaida e tiñan como obxectivo utilizar os resultados do experimento SPring-8 para avaliar se a entrega de LV-MP en presenza dun campo magnético podería mellorar a transferencia de xenes in vivo. .Para avaliar os efectos da MF e do campo magnético, tratáronse dous grupos de animais: un grupo foi inxectado con LV MF con colocación de imáns, e ao outro grupo inxectouse cun grupo control con LV MF sen imán.
Os vectores do xene LV foron xerados utilizando métodos anteriormente descritos 25, 26 .O vector LacZ expresa un xene da beta-galactosidasa localizado nuclearmente impulsado polo promotor constitutivo MPSV (LV-LacZ), que produce un produto de reacción azul nas células transducidas, visible nas frontes e seccións do tecido pulmonar.A titulación realizouse en cultivos celulares contando manualmente o número de células positivas para LacZ usando un hemocitómetro para calcular o título en TU/ml.Os portadores consérvanse criopreservados a -80 °C, desconxélanse antes do seu uso e únense a CombiMag mesturando 1:1 e incubando en xeo durante polo menos 30 minutos antes da entrega.
Ratas Sprague Dawley normais (n = 3/grupo, ~ 2-3 anestesiadas ip cunha mestura de 0,4 mg/kg de medetomidina (Domitor, Ilium, Australia) e 60 mg/kg de ketamina (Ilium, Australia) a 1 mes de idade) ip ) inxección e canulación oral non cirúrxica cunha cánula intravenosa de 16 Ga.Para garantir que o tecido da vía aérea traqueal recibe transdución do ventrículo izquierdo, acondicionouse mediante o noso protocolo de perturbación mecánica descrito anteriormente no que a superficie da vía aérea traqueal se fregaba axialmente cunha cesta de arame (N-Circle, extractor de pedras de nitinol sen punta NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, EUA) 30 p28.Despois, uns 10 minutos despois da perturbación no armario de bioseguridade, realizouse a administración traqueal de LV-MP.
O campo magnético usado neste experimento foi configurado de forma similar a un estudo de raios X in vivo, cos mesmos imáns suxeitos sobre a tráquea con abrazaderas de stent de destilación (Figura 4).Un volume de 50 µl (2 alícuotas de 25 µl) de LV-MP entregouse á tráquea (n = 3 animais) usando unha pipeta con punta de xel como se describiu anteriormente.O grupo control (n = 3 animais) recibiu o mesmo LV-MP sen o uso dun imán.Despois de completar a infusión, a cánula é eliminada do tubo endotraqueal e o animal é extubado.O imán permanece no seu lugar durante 10 minutos antes de ser retirado.As ratas administráronse por vía subcutánea con meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) seguido da retirada da anestesia mediante inxección intraperitoneal de 1 mg/kg de clorhidrato de atipamazol (Antisedan, Zoetis, Australia).As ratas mantivéronse quentes e observáronse ata a recuperación completa da anestesia.
Dispositivo de entrega LV-MP nun armario de seguridade biolóxica.Podes ver que o manguito Luer-lock gris claro do tubo ET sobresae da boca e a punta da pipeta de xel que se mostra na figura insírese a través do tubo ET ata a profundidade desexada na tráquea.
Unha semana despois do procedemento de administración de LV-MP, os animais foron sacrificados humanamente mediante a inhalación de CO2 ao 100% e a expresión de LacZ foi avaliada mediante o noso tratamento estándar X-gal.Retiráronse os tres aneis de cartilaxe máis caudais para garantir que calquera dano mecánico ou retención de líquidos debido á colocación do tubo endotraqueal non fose incluído na análise.Cada tráquea foi cortada lonxitudinalmente para obter dúas metades para a análise e colocouse nunha cunca que contiña caucho de silicona (Sylgard, Dow Inc) usando unha agulla Minutien (Fine Science Tools) para visualizar a superficie luminal.A distribución e o carácter das células transducidas confirmáronse mediante fotografía frontal utilizando un microscopio Nikon (SMZ1500) cunha cámara DigiLite e o software TCapture (Tucsen Photonics, China).As imaxes adquiríronse cun aumento de 20x (incluíndo a configuración máxima para o ancho total da tráquea), mostrando toda a lonxitude da tráquea paso a paso, proporcionando unha superposición suficiente entre cada imaxe para permitir que as imaxes se "cosen".As imaxes de cada tráquea combináronse despois nunha única imaxe composta usando o Editor de imaxes compostas versión 2.0.3 (Microsoft Research) usando o algoritmo de movemento plano. A área de expresión de LacZ dentro das imaxes compostas traqueais de cada animal cuantificouse mediante un script MATLAB automatizado (R2020a, MathWorks) como se describiu anteriormente28, utilizando axustes de 0,35 <Tonalidade <0,58, Saturación> 0,15 e Valor <0,7. A área de expresión de LacZ dentro das imaxes compostas traqueais de cada animal cuantificouse mediante un script MATLAB automatizado (R2020a, MathWorks) como se describiu anteriormente28, utilizando axustes de 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 e Value < 0,7. Пощадь экспрессии lacz в составных зобобаженихх трахеи от каждого животногhe ыыы коли cле 1. томатизированнoria сценария matlab (R2020a, Mathworks), как описано ранеcións28, с и итованиеorm и значение <0 ,7. A área de expresión de LacZ en imaxes traqueais compostas de cada animal cuantificouse mediante un script MATLAB automatizado (R2020a, MathWorks) como se describiu anteriormente28 usando a configuración de 0,350,15 e valor <0,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复的尔管复合帟管复合帟管复合帟复合帟述进行量化，使用0,35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 的 的 管 复表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。。 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。HIP Области экспрессии и н тоеи кажжыхобели то] ando тоел т fas а fas коло Esta то Así ированно�о сценария matlab (R2020a, Mathworks), как описано ранее, с с и олзовасано ранT е <0,7 . As áreas de expresión de LacZ en imaxes compostas da tráquea de cada animal cuantificáronse mediante un guión automatizado de MATLAB (R2020a, MathWorks) como se describiu anteriormente usando axustes de 0,35 < matiz < 0,58, saturación> 0,15 e valor < 0,7.Ao rastrexar os contornos do tecido en GIMP v2.10.24, creouse manualmente unha máscara para cada imaxe composta para identificar a área do tecido e evitar calquera detección falsa fóra do tecido traqueal.As áreas manchadas de todas as imaxes compostas de cada animal sumáronse para dar a área total de manchas para ese animal.A área pintada dividiuse entón pola área total da máscara para obter unha área normalizada.
Cada tráquea foi incrustada en parafina e seccionada de 5 µm de espesor.As seccións foron contrastadas con vermello rápido neutro durante 5 minutos e as imaxes foron adquiridas mediante un microscopio Nikon Eclipse E400, cámara DS-Fi3 e software de captura de elementos NIS (versión 5.20.00).
Todas as análises estatísticas realizáronse en GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).A significación estatística estableceuse en p ≤ 0,05.Probouse a normalidade mediante a proba de Shapiro-Wilk e avaliáronse as diferenzas na tinción con LacZ mediante unha proba t non pareada.
Os seis MP descritos na táboa 1 foron examinados polo PCXI, e a visibilidade descríbese na táboa 2. Dous MPs de poliestireno (MP1 e MP2; 18 µm e 0,25 µm, respectivamente) non foron visibles polo PCXI, pero as mostras restantes puideron identificarse. (os exemplos móstranse na Figura 5).MP3 e MP4 son débilmente visibles (10-15% Fe3O4; 0,25 µm e 0,9 µm, respectivamente).Aínda que MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) contiña algunhas das partículas máis pequenas probadas, foi a máis pronunciada.O produto CombiMag MP6 é difícil de distinguir.En todos os casos, a nosa capacidade para detectar MF mellorou moito ao mover o imán cara atrás e cara atrás paralelo ao capilar.A medida que os imáns se afastaban do capilar, as partículas foron retiradas en cadeas longas, pero a medida que os imáns se achegaban e a intensidade do campo magnético aumentaba, as cadeas de partículas acurtaban a medida que as partículas migraban cara á superficie superior do capilar (ver vídeo complementario S1). : MP4), aumentando a densidade de partículas na superficie.Pola contra, cando se retira o imán do capilar, a intensidade do campo diminúe e os MPs reordenan en longas cadeas que se estenden desde a superficie superior do capilar (ver Vídeo complementario S2: MP4).Despois de que o imán deixa de moverse, as partículas continúan movéndose durante algún tempo despois de alcanzar a posición de equilibrio.A medida que o MP se move cara e afastado da superficie superior do capilar, as partículas magnéticas tenden a atraer restos a través do líquido.
A visibilidade de MP baixo PCXI varía considerablemente entre as mostras.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6.Todas as imaxes mostradas aquí foron tomadas cun imán situado aproximadamente 10 mm directamente por riba do capilar.Os círculos aparentes son burbullas de aire atrapadas nos capilares, que mostran claramente as características do bordo branco e negro da imaxe de contraste de fase.O cadro vermello indica a ampliación que mellora o contraste.Teña en conta que os diámetros dos circuítos magnéticos en todas as figuras non están a escala e son aproximadamente 100 veces máis grandes do mostrado.
A medida que o imán se move á esquerda e á dereita pola parte superior do capilar, o ángulo da corda MP cambia para aliñarse co imán (ver Figura 6), delineando así as liñas do campo magnético.Para MP3-5, despois de que a corda alcance o ángulo de limiar, as partículas arrastran ao longo da superficie superior do capilar.Isto adoita dar lugar a que os MP se agrupen en grupos máis grandes preto de onde o campo magnético é máis forte (consulte o Vídeo complementario S3: MP5).Isto tamén é especialmente evidente cando se toma imaxes preto do final do capilar, o que fai que o MP se agregue e se concentre na interface líquido-aire.As partículas do MP6, que eran máis difíciles de distinguir que as do MP3-5, non se arrastraron cando o imán se movía ao longo do capilar, pero as cordas MP disociaron, deixando as partículas á vista (ver Vídeo complementario S4: MP6).Nalgúns casos, cando o campo magnético aplicado se reduciu movendo o imán a unha longa distancia do lugar da imaxe, os MP restantes descendían lentamente á superficie inferior do tubo por gravidade, permanecendo na corda (ver Vídeo complementario S5: MP3). .
O ángulo da corda MP cambia a medida que o imán se move cara á dereita sobre o capilar.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6.O cadro vermello indica a ampliación que mellora o contraste.Teña en conta que os vídeos adicionais teñen fins informativos xa que revelan unha estrutura de partículas importante e información dinámica que non se pode visualizar nestas imaxes estáticas.
As nosas probas demostraron que mover o imán cara atrás e cara atrás lentamente ao longo da tráquea facilita a visualización do MF no contexto dun movemento complexo in vivo.Non se realizaron probas in vivo porque as perlas de poliestireno (MP1 e MP2) non eran visibles no capilar.Cada un dos catro MF restantes probouse in vivo co eixe longo do imán colocado sobre a tráquea nun ángulo duns 30° respecto á vertical (ver as figuras 2b e 3a), xa que isto deu lugar a cadeas MF máis longas e foi máis eficaz. que un imán..configuración finalizada.Non se atoparon MP3, MP4 e MP6 na tráquea de ningún animal vivo.Ao visualizar o tracto respiratorio das ratas despois de matar humanamente aos animais, as partículas permaneceron invisibles aínda que se engade volume adicional usando unha bomba de xeringa.MP5 tiña o maior contido de óxido de ferro e era a única partícula visible, polo que se utilizou para avaliar e caracterizar o comportamento de MP in vivo.
A colocación do imán sobre a tráquea durante a inserción de MF deu lugar a que moitos, pero non todos, se concentrasen no campo de visión.A entrada traqueal de partículas obsérvase mellor en animais sacrificados de forma humana.A figura 7 e o vídeo complementario S6: MP5 mostra a rápida captura magnética e o aliñamento de partículas na superficie da tráquea ventral, o que indica que os MP poden ser dirixidos ás áreas desexadas da tráquea.Ao buscar máis distalmente ao longo da tráquea despois da entrega de MF, algúns MF atopáronse máis preto da carina, o que indica unha intensidade do campo magnético insuficiente para recoller e manter todos os MF, xa que foron entregados a través da rexión de máxima intensidade do campo magnético durante a administración do fluído.proceso.Non obstante, as concentracións de MP posnatais foron máis altas ao redor da área da imaxe, o que suxire que moitos MP permaneceron nas rexións das vías aéreas onde a intensidade do campo magnético aplicado era máis alta.
Imaxes de (a) antes e (b) despois da entrega de MP5 na tráquea dunha rata recentemente sacrificada cun imán colocado xusto encima da área de imaxe.A zona representada está situada entre dous aneis cartilaxinosos.Hai algo de líquido nas vías respiratorias antes de que se entregue o MP.O cadro vermello indica a ampliación que mellora o contraste.Estas imaxes están tomadas do vídeo que aparece en S6: Vídeo complementario MP5.
Mover o imán ao longo da tráquea in vivo provocou un cambio no ángulo da cadea MP na superficie das vías respiratorias, similar ao observado nos capilares (ver a Figura 8 e o Vídeo complementario S7: MP5).Non obstante, no noso estudo, os MPs non podían ser arrastrados pola superficie das vías respiratorias vivas, como poderían facer os capilares.Nalgúns casos, a cadea MP alóngase mentres o imán se move á esquerda e á dereita.Curiosamente, tamén descubrimos que a cadea de partículas cambia a profundidade da capa superficial do fluído cando o imán se move lonxitudinalmente ao longo da tráquea, e se expande cando o imán se move directamente sobre a cabeza e a cadea de partículas se xira a unha posición vertical (ver Vídeo complementario S7).: MP5 ás 0:09, inferior dereita).O patrón de movemento característico cambiou cando o imán foi movido lateralmente pola parte superior da tráquea (é dicir, á esquerda ou á dereita do animal, en lugar de ao longo da traquea).As partículas aínda eran claramente visibles durante o seu movemento, pero cando se retirou o imán da tráquea, as puntas das cordas de partículas fixéronse visibles (ver Vídeo complementario S8: MP5, a partir das 0:08).Isto concorda co comportamento observado do campo magnético baixo a acción dun campo magnético aplicado nun capilar de vidro.
Imaxes de mostra que mostran MP5 na tráquea dunha rata anestesiada viva.(a) O imán úsase para adquirir imaxes enriba e á esquerda da tráquea, despois (b) despois de mover o imán cara á dereita.O cadro vermello indica a ampliación que mellora o contraste.Estas imaxes son do vídeo que aparece no vídeo complementario de S7: MP5.
Cando os dous polos estaban sintonizados nunha orientación norte-sur por riba e por debaixo da tráquea (é dicir, atraendo; Fig. 3b), as cordas MP parecían máis longas e estaban situadas na parede lateral da tráquea e non na superficie dorsal da traquea. traquea (ver apéndice).Vídeo S9:MP5).Non obstante, non se detectaron altas concentracións de partículas nun sitio (é dicir, a superficie dorsal da tráquea) despois da administración de fluídos mediante un dispositivo de dobre imán, que normalmente ocorre cun dispositivo de imán único.Entón, cando un imán foi configurado para repeler polos opostos (Figura 3c), o número de partículas visibles no campo de visión non aumentou despois da entrega.Configurar ambas as dúas configuracións de imáns é un reto debido á alta intensidade do campo magnético que atrae ou empuxa os imáns respectivamente.A configuración cambiouse entón a un único imán paralelo ás vías aéreas pero que pasaba polas vías aéreas nun ángulo de 90 graos para que as liñas de forza cruzasen ortogonalmente a parede traqueal (Figura 3d), unha orientación destinada a determinar a posibilidade de agregación de partículas no a parede lateral.ser observado.Non obstante, nesta configuración, non houbo movemento de acumulación de MF ou movemento de imán identificable.En base a todos estes resultados, escolleuse unha configuración cun só imán e unha orientación de 30 graos para estudos in vivo de portadores de xenes (Fig. 3a).
Cando o animal foi capturado varias veces inmediatamente despois de ser sacrificado humanamente, a ausencia de movemento do tecido interferente fixo que se puidesen discernir liñas de partículas máis finas e máis curtas no claro campo intercartilaxinoso, "baciándose" segundo o movemento de translación do imán.ver claramente a presenza e o movemento das partículas MP6.
O título de LV-LacZ foi de 1,8 x 108 UI/ml, e despois de mesturar 1:1 con CombiMag MP (MP6), os animais foron inxectados con 50 µl dunha dose traqueal de 9 x 107 UI/ml de vehículo LV (é dicir, 4,5 x 106 TU/rata).).).Nestes estudos, en lugar de mover o imán durante o traballo, fixamos o imán nunha posición para determinar se a transdución do ventrículo izquierdo podería (a) mellorarse en comparación coa entrega de vectores en ausencia de campo magnético e (b) se a vía aérea podería estar enfocado.As células son transducidas nas áreas diana magnéticas do tracto respiratorio superior.
A presenza de imáns e o uso de CombiMag en combinación con vectores LV non parecían afectar negativamente á saúde animal, como o fixo o noso protocolo estándar de entrega de vectores LV.As imaxes frontais da rexión traqueal sometida a perturbación mecánica (figura complementaria 1) mostraron que o grupo tratado con LV-MP tiña niveis de transdución significativamente máis altos en presenza dun imán (figura 9a).Só unha pequena cantidade de cor azul LacZ estaba presente no grupo control (Figura 9b).A cuantificación das rexións normalizadas tinguidas con X-Gal mostrou que a administración de LV-MP en presenza dun campo magnético resultou nunha mellora de aproximadamente 6 veces (Fig. 9c).
Exemplo de imaxes compostas que mostran transdución traqueal con LV-MP (a) en presenza dun campo magnético e (b) en ausencia dun imán.(c) Mellora estatisticamente significativa na área normalizada de transdución de LacZ na tráquea co uso dun imán (*p = 0,029, proba t, n = 3 por grupo, media ± erro estándar da media).
As seccións neutras e rápidas tinguidas de vermello (exemplo mostrado na figura complementaria 2) indicaron que as células tinguidas con LacZ estaban presentes na mesma mostra e no mesmo lugar que se informou anteriormente.
O reto clave na terapia xénica das vías aéreas segue sendo a localización precisa das partículas portadoras nas áreas de interese e a consecución dun alto nivel de eficiencia de transdución no pulmón móbil en presenza de fluxo de aire e depuración activa do moco.Para os portadores de VI destinados ao tratamento de enfermidades respiratorias na fibrose quística, aumentar o tempo de residencia das partículas portadoras nas vías aéreas condutoras era ata agora un obxectivo inalcanzable.Como sinalan Castellani et al., o uso de campos magnéticos para mellorar a transdución ten vantaxes sobre outros métodos de entrega de xenes como a electroporación porque pode combinar simplicidade, economía, entrega localizada, maior eficiencia e menor tempo de incubación.e posiblemente unha menor dose de vehículo10.Porén, a deposición e o comportamento in vivo de partículas magnéticas nas vías aéreas baixo a influencia de forzas magnéticas externas nunca se describiu, e de feito non se demostrou in vivo a capacidade deste método para aumentar os niveis de expresión xénica nas vías respiratorias vivas intactas.
Os nosos experimentos in vitro no sincrotrón PCXI mostraron que todas as partículas que probamos, a excepción do poliestireno MP, eran visibles na configuración de imaxe que usamos.En presenza dun campo magnético, os campos magnéticos forman cordas, cuxa lonxitude está relacionada co tipo de partículas e a intensidade do campo magnético (é dicir, a proximidade e o movemento do imán).Como se mostra na Figura 10, as cordas que observamos fórmanse a medida que cada partícula individual se imanta e induce o seu propio campo magnético local.Estes campos separados fan que outras partículas similares se recollan e se conecten cos movementos de cordas grupais debido ás forzas locais das forzas locais de atracción e repulsión doutras partículas.
Diagrama que mostra (a, b) cadeas de partículas que se forman dentro de capilares cheos de fluído e (c, d) unha tráquea chea de aire.Teña en conta que os capilares e a tráquea non están debuxados a escala.O panel (a) tamén contén unha descrición do MF que contén partículas de Fe3O4 dispostas en cadeas.
Cando o imán se moveu sobre o capilar, o ángulo da corda de partículas alcanzou o limiar crítico para o MP3-5 que contén Fe3O4, despois do cal a corda de partículas xa non permaneceu na súa posición orixinal, senón que se moveu ao longo da superficie a unha nova posición.imán.Este efecto probablemente ocorre porque a superficie do capilar de vidro é o suficientemente suave como para permitir que se produza este movemento.Curiosamente, MP6 (CombiMag) non se comportou deste xeito, quizais porque as partículas eran máis pequenas, tiñan un revestimento ou unha carga superficial diferente ou o fluído portador propietario afectaba a súa capacidade de movemento.O contraste na imaxe de partículas CombiMag tamén é máis débil, o que suxire que o líquido e as partículas poden ter a mesma densidade e, polo tanto, non poden moverse facilmente entre si.As partículas tamén poden atascarse se o imán se move demasiado rápido, o que indica que a intensidade do campo magnético non sempre pode superar a fricción entre as partículas do fluído, o que suxire que a intensidade do campo magnético e a distancia entre o imán e a área obxecto de aprendizaxe non deberían ser sorpresa.importante.Estes resultados tamén indican que aínda que os imáns poden capturar moitas micropartículas que flúen pola zona obxecto de aprendizaxe, é pouco probable que se poida confiar nos imáns para mover as partículas CombiMag ao longo da superficie da tráquea.Así, concluímos que os estudos in vivo de LV MF deberían usar campos magnéticos estáticos para dirixirse fisicamente a áreas específicas da árbore das vías aéreas.
Unha vez que as partículas son enviadas ao corpo, son difíciles de identificar no contexto do complexo tecido móbil do corpo, pero a súa capacidade de detección mellorouse ao mover o imán horizontalmente sobre a tráquea para "mover" as cordas MP.Aínda que é posible obter imaxes en tempo real, é máis fácil discernir o movemento das partículas despois de que o animal fose asasinado humanamente.As concentracións de MP eran xeralmente máis altas neste lugar cando o imán estaba situado sobre a área de imaxe, aínda que algunhas partículas adoitaban atoparse máis abaixo da tráquea.A diferenza dos estudos in vitro, as partículas non se poden arrastrar pola tráquea polo movemento dun imán.Este achado é consistente coa forma en que o moco que cobre a superficie da tráquea procesa normalmente as partículas inhaladas, atrapándoas no moco e limpándoas posteriormente a través do mecanismo de eliminación muco-ciliar.
A hipótese de que o uso de imáns por riba e por debaixo da tráquea para a atracción (Fig. 3b) podería producir un campo magnético máis uniforme, en lugar dun campo magnético que está moi concentrado nun punto, o que pode producir unha distribución máis uniforme das partículas..Non obstante, o noso estudo preliminar non atopou evidencia clara para apoiar esta hipótese.Do mesmo xeito, establecer un par de imáns para repeler (Fig. 3c) non deu lugar a unha maior sedimentación de partículas na zona da imaxe.Estes dous achados demostran que a configuración de dobre imán non mellora significativamente o control local do apuntamento MP, e que as fortes forzas magnéticas resultantes son difíciles de sintonizar, o que fai que este enfoque sexa menos práctico.Do mesmo xeito, orientar o imán por riba e a través da tráquea (Figura 3d) tampouco aumentou o número de partículas que permanecen na zona da imaxe.Algunhas destas configuracións alternativas poden non ter éxito xa que producen unha redución da intensidade do campo magnético na zona de deposición.Así, a configuración de imán único a 30 graos (Fig. 3a) considérase o método de proba in vivo máis sinxelo e eficiente.
O estudo LV-MP mostrou que cando os vectores LV foron combinados con CombiMag e entregados despois de ser perturbados fisicamente en presenza dun campo magnético, os niveis de transdución aumentaron significativamente na tráquea en comparación cos controis.En base a estudos de imaxes de sincrotrón e os resultados de LacZ, o campo magnético parecía ser capaz de manter o ventrículo izquierdo na tráquea e reducir o número de partículas vectoriais que penetraron inmediatamente profundamente no pulmón.Tales melloras de orientación poden levar a unha maior eficiencia mentres reducen os títulos entregados, a transdución non dirixida, os efectos secundarios inflamatorios e inmunes e os custos de transferencia de xenes.É importante destacar que, segundo o fabricante, CombiMag pódese usar en combinación con outros métodos de transferencia de xenes, incluíndo outros vectores virais (como AAV) e ácidos nucleicos.