Grazas por visitar Nature.com.A versión do navegador que estás a usar ten soporte CSS limitado.Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, renderizaremos o sitio sen estilos e JavaScript.
Toxoplasma gondii é un protozoo parasito intracelular que modula o microambiente do hóspede infectado e sábese que está asociado coa incidencia do crecemento do tumor cerebral.Neste estudo, formulamos a hipótese de que o miRNA-21 exosomal da infección por Toxoplasma promove o crecemento do tumor cerebral.Caracterizáronse exosomas da microglia BV2 infectada por Toxoplasma e confirmouse a internalización das células do glioma U87.Os perfís de expresión de microARN exosomal analizáronse utilizando matrices de microARN e microARN-21A-5p asociados con Toxoplasma gondii e a clasificación de tumores.Tamén investigamos os niveis de ARNm dos xenes asociados a tumores en células de glioma U87 alterando os niveis de miR-21 nos exosomas e o efecto dos exosomas na proliferación de células de glioma U87 humano.Nos exosomas de células de glioma U87 infectadas con Toxoplasma gondii, a expresión do microARN-21 aumenta e a actividade dos xenes antitumorales (FoxO1, PTEN e PDCD4) redúcese.Os exosomas derivados de BV2 infectados con Toxoplasma inducen a proliferación de células de glioma U87.Os exosomas inducen o crecemento das células U87 nun modelo de tumor de rato.Suxerimos que o aumento do miR-21 exosomal na microglia BV2 infectada por Toxoplasma pode desempeñar un papel importante como promotor do crecemento celular nas células de glioma U87 ao baixar os xenes antitumorales.
Estímase que en 2018 foron diagnosticados máis de 18,1 millóns de casos de cancro avanzado en todo o mundo, con preto de 297.000 tumores do sistema nervioso central diagnosticados cada ano (o 1,6% de todos os tumores)1.Investigacións anteriores demostraron que os factores de risco para o desenvolvemento de tumores cerebrais humanos inclúen diversos produtos químicos, antecedentes familiares e radiacións ionizantes procedentes de equipos terapéuticos e de diagnóstico da cabeza.Non obstante, descoñécese a causa exacta destas neoplasias.Aproximadamente o 20% de todos os cancros no mundo son causados ​​por axentes infecciosos, incluíndo virus, bacterias e parasitos3,4.Os patóxenos infecciosos perturban os mecanismos xenéticos da célula hóspede, como a reparación do ADN e o ciclo celular, e poden provocar inflamación crónica e danos ao sistema inmunitario5.
Os axentes infecciosos asociados ao cancro humano son os patóxenos virais máis comúns, incluíndo os virus do papiloma humano e os virus da hepatite B e C.Os parasitos tamén poden desempeñar un papel potencial no desenvolvemento do cancro humano.Varias especies de parasitos, a saber, Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis e Hymenolepis nana, estiveron implicadas en varios tipos de cancro humano 6,7,8.
Toxoplasma gondii é un protozoo intracelular que regula o microambiente das células hóspedes infectadas.Estímase que este parasito infecta aproximadamente o 30% da poboación mundial, poñendo en risco a toda a poboación9,10.Toxoplasma gondii pode infectar órganos vitais, incluído o sistema nervioso central (SNC), e causar enfermidades graves como meninxite e encefalite mortais, especialmente en pacientes inmunocomprometidos9.Non obstante, Toxoplasma gondii tamén pode alterar o ambiente do hóspede infectado modulando o crecemento celular e as respostas inmunes en individuos inmunocompetentes, o que leva ao mantemento dunha infección crónica asintomática9,11.Curiosamente, dada a correlación entre a prevalencia de T. gondii e a incidencia de tumores cerebrais, algúns informes suxiren que os cambios ambientais do hóspede in vivo debido á infección crónica por T. gondii semellan o microambiente do tumor.
Os exosomas son coñecidos como comunicadores intercelulares que proporcionan contido biolóxico, incluíndo proteínas e ácidos nucleicos, das células veciñas16,17.Os exosomas poden influír nos procesos biolóxicos relacionados co tumor, como a antiapoptose, a anxioxénese e a metástase no microambiente do tumor.En particular, os miRNAs (miRNAs), pequenos ARN non codificantes duns 22 nucleótidos de lonxitude, son importantes reguladores de xenes post-transcripcionais que controlan máis do 30% do ARNm humano a través do complexo de silenciamento inducido por miARN (miRISC).Toxoplasma gondii pode alterar os procesos biolóxicos controlando a expresión de miARN nos hóspedes infectados.Os miARN do hóspede conteñen sinais importantes para regular os procesos biolóxicos do hóspede para conseguir a estratexia de supervivencia do parasito.Así, estudar os cambios no perfil do miARN do hóspede tras a infección por T. gondii pode axudarnos a comprender con máis claridade a interacción entre o hóspede e T. gondii.De feito, Thirugnanam et al.15 suxeriu que T. gondii promove a carcinoxénese cerebral ao alterar a súa expresión en miARN específicos do hóspede asociados ao crecemento do tumor e descubriu que T. gondii pode causar gliomas en animais experimentais.
Este estudo céntrase na alteración do miR-21 exosomal na microglia do hóspede infectada con Toxoplasma BV2.Observamos un posible papel do miR-21 exosomal alterado no crecemento das células do glioma U87 debido á retención no núcleo de FoxO1/p27, que é o obxectivo do miR-21 sobreexpresado.
Os exosomas derivados de BV2 obtivéronse mediante centrifugación diferencial e validáronse por diversos métodos para evitar a contaminación con compoñentes celulares ou outras vesículas.A electroforese en xel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) mostrou patróns distintos entre as proteínas extraídas das células BV2 e os exosomas (Figura 1A), e as mostras avaliáronse para determinar a presenza de Alix, que se analizou mediante transferencia Western de marcadores de proteínas exosomáis en .A etiquetaxe Alix atopouse en proteínas exosomas pero non nas proteínas lisadas de células BV2 (Fig. 1B).Ademais, analizouse o ARN purificado dos exosomas derivados de BV2 mediante un bioanalizador.As subunidades ribosómicas 18S e 28S observáronse raramente no patrón de migración do ARN exosomal, o que indica unha pureza fiable (Figura 1C).Finalmente, a microscopía electrónica de transmisión mostrou que os exosomas observados tiñan un tamaño duns 60-150 nm e tiñan unha estrutura tipo copa típica da morfoloxía dos exosomas (Fig. 1D).
Caracterización de exosomas derivados de células BV2.(A) Páxina da ficha de datos de seguridade.Illáronse as proteínas de células BV2 ou exosomas derivados de BV2.Os patróns de proteínas difiren entre as células e os exosomas.(B) Análise Western blot dun marcador exosomal (Alix).(C) Avaliación do ARN purificado de células BV2 e exosomas derivados de BV2 mediante un bioanalizador.Así, as subunidades ribosómicas 18S e 28S nas células BV2 raramente se atoparon no ARN exosomal.(D) A microscopía electrónica de transmisión mostrou que os exosomas illados das células BV2 estaban tinguidos negativamente con acetato de uranilo ao 2%.Os exosomas teñen aproximadamente 60-150 nm de tamaño e forma de copa (Song e Jung, datos inéditos).
Observouse a interiorización celular de exosomas derivados de BV2 en células de glioma humano U87 mediante microscopía confocal.Os exosomas marcados con PKH26 localízanse no citoplasma das células U87.Os núcleos foron tinguidos con DAPI (Fig. 2A), o que indica que os exosomas derivados de BV2 poden ser interiorizados polas células hóspedes e influír no ambiente das células receptoras.
A internalización de exosomas derivados de BV2 en células de glioma U87 e exosomas derivados de BV2 infectados con Toxoplasma RH induciu a proliferación de células de glioma U87.(A) Exosomas engulidos por células U87 medidos por microscopía confocal.As células de glioma U87 incubáronse con exosomas marcados con PKH26 (vermello) ou sen control durante 24 horas.Os núcleos foron tinguidos con DAPI (azul) e despois observáronse baixo un microscopio confocal (barra de escala: 10 μm, x 3000).(B) A proliferación celular do glioma U87 determinouse mediante un ensaio de proliferación celular.As células de glioma U87 foron tratadas con exosomas durante o tempo indicado. * P < 0,05 obtívose mediante a proba t de Student. * P < 0,05 obtívose mediante a proba t de Student. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 pola proba t de Student. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 obtido mediante a proba t de Student.
Despois de confirmar a internalización de exosomas derivados de BV2 en células de glioma U87, realizamos ensaios de proliferación celular para investigar o papel dos exosomas derivados de Toxoplasma derivados de BV2 no desenvolvemento de células de glioma humano.O tratamento das células U87 con exosomas de células BV2 infectadas por T. gondii mostrou que os exosomas derivados de BV2 infectados por T. gondii causaron unha proliferación significativamente maior de células U87 en comparación co control (Fig. 2B).
Ademais, o crecemento das células U118 tivo os mesmos resultados que o U87, xa que os exosomas estimulados por Toxoplasma provocaron os niveis máis altos de proliferación (datos non mostrados).En base a estes datos, podemos indicar que os exosomas infectados con Toxoplasma derivados de BV2 xogan un papel importante na proliferación das células do glioma.
Para investigar o efecto dos exosomas derivados de BV2 infectados por Toxoplasma sobre o desenvolvemento do tumor, inxectamos células de glioma U87 en ratos espidos para un modelo de xenoinjerto e inxectamos exosomas derivados de BV2 ou exosomas derivados de BV2 infectados con RH.Despois de que os tumores se fixeron evidentes despois de 1 semana, cada grupo experimental de 5 ratos dividiuse segundo o tamaño do tumor para determinar o mesmo punto de partida, e o tamaño do tumor foi medido durante 22 días.
En ratos co modelo de xenograft U87, no día 22 observáronse o tamaño e o peso do tumor significativamente maior no grupo de exosomas infectados por RH derivado de BV2 (Fig. 3A, B).Por outra banda, non houbo diferenza significativa no tamaño do tumor entre o grupo de exosomas derivados de BV2 e o grupo control despois do tratamento con exosomas.Ademais, os ratos inxectados con células de glioma e exosomas mostraron visualmente o maior volume tumoral no grupo de exosomas derivados de BV2 infectados por RH (Fig. 3C).Estes resultados demostran que os exosomas infectados por Toxoplasma derivados de BV2 inducen o crecemento do glioma nun modelo de tumor de rato.
Oncoxénese (AC) de exosomas derivados de BV2 nun modelo de rato con xenoinjerto U87.O tamaño do tumor (A) e o peso (B) aumentaron significativamente en ratos nudos BALB/c tratados con exosomas infectados con RH derivados de BV2.Os ratos nudos BALB/c (C) foron inxectados por vía subcutánea con 1 x 107 células U87 suspendidas nunha mestura de Matrigel.Seis días despois da inxección, 100 μg de exosomas derivados de BV2 foron tratados en ratos.O tamaño e o peso do tumor foron medidos nos días indicados e despois do sacrificio, respectivamente. *P < 0,05. *P < 0,05. * Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. * Р < 0,05. *P < 0,05.
Os datos mostraron que 37 miRNAs (16 sobreexpresados ​​e 21 desexpresados) asociados coa inmunidade ou o desenvolvemento do tumor foron significativamente alterados na microglia tras a infección coa cepa Toxoplasma RH (Fig. 4A).Os niveis de expresión relativa de miR-21 entre os miARN alterados confirmáronse mediante RT-PCR en tempo real en exosomas derivados de BV2, exosomas tratados con células BV2 e U87.A expresión de miR-21 mostrou un aumento significativo dos exosomas das células BV2 infectadas con Toxoplasma gondii (cepa RH) (Fig. 4B).Os niveis de expresión relativa de miR-21 en células BV2 e U87 aumentaron despois da captación de exosomas alterados (Fig. 4B).Os niveis relativos de expresión de miR-21 nos tecidos cerebrais dos pacientes con tumor e dos ratos infectados con Toxoplasma gondii (cepa ME49) foron superiores aos dos controis, respectivamente (Fig. 4C).Estes resultados correlacionan con diferenzas entre os niveis de expresión dos microARN previstos e confirmados in vitro e in vivo.
Cambios na expresión de miP-21a-5p exosomal na microglia infectada con Toxoplasma gondii (RH).(A) Demostra cambios significativos no siRNA asociados coa inmunidade ou o desenvolvemento do tumor despois da infección por T. gondii RH.(B) Os niveis de expresión de miR-21 relativos detectáronse mediante RT-PCR en tempo real en exosomas derivados de BV2, exosomas tratados con BV2 e células U87.(C) Atopáronse niveis de expresión de miR-21 relativos nos tecidos cerebrais de pacientes con tumor (N = 3) e ratos infectados con Toxoplasma gondii (cepa ME49) (N = 3). * P < 0,05 obtívose mediante a proba t de Student. * P < 0,05 obtívose mediante a proba t de Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 obtívose mediante a proba t de Student. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 obtido mediante a proba t de Student.
Os exosomas de células BV2 infectadas por RH provocaron o crecemento de gliomas in vivo e in vitro (fig. 2, 3).Para detectar ARNm relevantes, examinamos os niveis de ARNm de xenes diana antitumorales, caixa de forkhead O1 (FoxO1), PTEN e morte celular programada 4 (PDCD4) en células U87 infectadas con exosomas derivados de BV2 ou RH BV2.A análise bioinformática demostrou que varios xenes asociados a tumores, incluídos os xenes FoxO1, PTEN e PDCD4, teñen sitios de unión miR-2121,22.Os niveis de ARNm dos xenes diana antitumorales reducíronse nos exosomas derivados de BV2 infectados con RH en comparación cos exosomas derivados de BV2 (Fig. 5A).FoxO1 mostrou niveis de proteína reducidos nos exosomas derivados de BV2 infectados con RH en comparación cos exosomas derivados de BV2 (Figura 5B).En base a estes resultados, poderiamos confirmar que os exosomas derivados de BV2 infectado por RH regulan á baixa os xenes anti-oncoxénicos, mantendo o seu papel no crecemento do tumor.
Os exosomas derivados de BV2 infectados por Toxoplasma RH inducen a supresión dos xenes antitumorales nas células de glioma U87 por exosomas derivados de BV2 infectados por Toxoplasma RH.(A) PCR en tempo real da expresión de FoxO1, PTEN e PDCD4 en exosomas derivados de BV2 infectado con RH de T. gondii en comparación cos exosomas de PBS.Utilizouse ARNm de β-actina como control.(B) A expresión de FoxO1 determinouse mediante transferencia Western e os datos de densitometría avaliáronse estatisticamente mediante o programa ImageJ. * P < 0,05 obtívose mediante a proba t de Student. * P < 0,05 obtívose mediante a proba t de Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 obtívose mediante a proba t de Student. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 obtido mediante a proba t de Student.
Para comprender o efecto de miP-21 nos exosomas na regulación xenética asociada ao tumor, transfectáronse células U87 cun inhibidor de miP-21 usando Lipofectamine 2000 e recolléronse as células 24 horas despois da transfección.Os niveis de expresión de FoxO1 e p27 en células transfectadas con inhibidores de miR-21 comparáronse con células tratadas con exosomas derivados de BV2 mediante qRT-PCR (Fig. 6A, B).A transfección do inhibidor de miR-21 en células U87 regulou significativamente a expresión de FoxO1 e p27 (Figura 6).
MiP-21 exosomal derivado de BV2 infectado con RH alterou a expresión de FoxO1/p27 nas células de glioma U87.As células U87 transfectáronse cun inhibidor de miP-21 usando Lipofectamine 2000 e as células recolléronse 24 horas despois da transfección.Os niveis de expresión de FoxO1 e p27 en células transfectadas con inhibidores de miR-21 comparáronse cos niveis de células tratadas con exosomas derivados de BV2 mediante qRT-PCR (A, B).
Para escapar da resposta inmune do hóspede, o parasito Toxoplasma transfórmase nun quiste tisular.Parasitan varios tecidos, incluíndo o cerebro, o corazón e o músculo esquelético, ao longo da vida do hóspede e modulan a resposta inmune do hóspede.Ademais, poden regular o ciclo celular e a apoptose das células hóspedes, favorecendo a súa proliferación14,24.Toxoplasma gondii infecta predominantemente as células dendríticas do hóspede, os neutrófilos e a liñaxe de monocitos/macrófagos, incluída a microglía cerebral.Toxoplasma gondii induce a diferenciación de macrófagos do fenotipo M2, afecta a cicatrización de feridas despois da infección por patóxenos e tamén se asocia coa hipervascularización e a fibrose granulomatosa.Esta patoxénese do comportamento da infección por Toxoplasma pode estar relacionada con marcadores asociados ao desenvolvemento do tumor.O ambiente hostil regulado por Toxoplasma pode parecerse ao precancro correspondente.Polo tanto, pódese supoñer que a infección por Toxoplasma debería contribuír ao desenvolvemento de tumores cerebrais.De feito, reportáronse altas taxas de infección por Toxoplasma no soro de pacientes con varios tumores cerebrais.Ademais, Toxoplasma gondii pode ser outro efector canceríxeno e actuar de forma sinérxica para axudar a outros carcinóxenos infecciosos a desenvolver tumores cerebrais.Neste sentido, cómpre sinalar que P. falciparum e o virus de Epstein-Barr contribúen sinérxicamente á formación do linfoma de Burkitt.
O papel dos exosomas como reguladores no campo da investigación do cancro foi amplamente investigado.Non obstante, o papel dos exosomas entre os parasitos e os hóspedes infectados segue sendo pouco coñecido.Ata o momento, varios reguladores, incluídas as proteínas secretadas, explicaron os procesos biolóxicos polos que os parasitos protozoarios resisten o ataque do hóspede e perpetúan a infección.Recentemente, houbo un concepto crecente de que as microvesículas asociadas a protozoos e os seus microARN interactúan coas células hóspedes para crear un ambiente favorable para a súa supervivencia.Polo tanto, son necesarios máis estudos para descubrir a relación entre os miARN exosomáticos alterados e a proliferación de células de glioma.A alteración do microARN (xenes agrupados miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 e miR-17-92) únese ao promotor STAT3 en macrófagos humanos infectados con toxoplasma, regúlase e induce anti -apoptose en resposta á infección por Toxoplasma gondii 29 .A infección por toxoplasma aumenta a expresión de miR-17-5p e miR-106b-5p, que están asociados a varias enfermidades hiperproliferativas 30 .Estes datos suxiren que os miARN do hóspede regulados pola infección por Toxoplasma son moléculas importantes para a supervivencia do parasito e a patoxénese no comportamento biolóxico do hóspede.
Os miARN alterados poden influír en varios tipos de comportamento durante o inicio e a progresión das células malignas, incluídos os gliomas: autosuficiencia dos sinais de crecemento, insensibilidade aos sinais que inhiben o crecemento, evasión da apoptose, potencial replicativo ilimitado, anxioxénese, invasión e metástase e inflamación.No glioma, identificáronse miARN alterados en varios estudos de perfís de expresión.
No presente estudo, confirmamos altos niveis de expresión de miRNA-21 en células hóspedes infectadas por toxoplasma.O miR-21 identificouse como un dos microARN sobreexpresados ​​con máis frecuencia en tumores sólidos, incluídos os gliomas, 33 e a súa expresión correlaciona co grao do glioma.A evidencia acumulada suxire que o miR-21 é un novo oncoxene que actúa como un factor antiapoptótico no crecemento do glioma e que está moi sobreexpresado nos tecidos e no plasma de tumores malignos do cerebro humano.Curiosamente, a inactivación de miR-21 en células e tecidos de glioma desencadea a inhibición da proliferación celular debido á apoptose dependente da caspase.A análise bioinformática dos obxectivos previstos de miR-21 revelou múltiples xenes supresores de tumores asociados ás vías de apoptose, incluíndo a morte celular programada 4 (PDCD4), tropomiosina (TPM1), PTEN e forkhead box O1 (FoxO1), co sitio de unión de miR-2121..22.38.
FoxO1, como un dos factores de transcrición (FoxO), está implicado no desenvolvemento de varios tipos de cancro humano e pode regular a expresión de xenes supresores de tumores como p21, p27, Bim e FasL40.FoxO1 pode unirse e activar inhibidores do ciclo celular como p27 para suprimir o crecemento celular.Ademais, FoxO1 é un efector clave da sinalización PI3K/Akt e regula moitos procesos biolóxicos como a progresión do ciclo celular e a diferenciación celular mediante a activación da transcrición p2742.
En conclusión, cremos que o miR-21 exosomal derivado da microglia infectada por Toxoplasma pode desempeñar un papel importante como regulador do crecemento das células do glioma (Fig. 7).Non obstante, son necesarios máis estudos para atopar unha conexión directa entre o miR-21 exosomal, a infección por Toxoplasma alterada e o crecemento do glioma.Espérase que estes resultados proporcionen un punto de partida para estudar a relación entre a infección por Toxoplasma e a incidencia do glioma.
Neste estudo proponse un diagrama esquemático do mecanismo da carcinoxénese do glioma (cerebro).O autor debuxa en PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Todos os protocolos experimentais deste estudo, incluído o uso de animais, estaban de acordo coas Pautas Éticas Estándar do Comité de Usuarios e Coidado de Animais da Universidade Nacional de Seúl e foron aprobados polo Consello de Revisión Institucional da Escola de Medicina da Universidade Nacional de Seúl (número IRB SNU-). 150715).-2).Todos os procedementos experimentais realizáronse de acordo coas recomendacións de ARRIVE.
Cultiváronse células de microglía de rato BV2 e de glioma humano U87 no medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Welgene, Seúl, Corea) e no medio do Instituto Roswell Park Memorial (RPMI; Welgene), respectivamente, cada un contén un 10% de soro fetal bovino, 4 mM l- glutamina, penicilina 0,2 mM e estreptomicina 0,05 mM.Cultiváronse as células nunha incubadora cun 5% de CO2 a 37 °C.Outra liña celular de glioma, U118, utilizouse para comparar coas células U87.
Para illar exosomas de cepas RH e ME49 infectadas por T. gondii, recolléronse taquizoítos de T. gondii (cepa RH) da cavidade abdominal de ratos BALB/c de 6 semanas de idade inxectados 3-4 días antes.Os taquizoítos laváronse tres veces con PBS e purificáronse por centrifugación en Percoll ao 40 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA)43.Para obter taquizoítos da cepa ME49, os ratos BALB/c foron inxectados por vía intraperitoneal con 20 quistes de tecido e a transformación de taquizoítos en quistes foi recollida lavando a cavidade abdominal entre os días 6 e 8 despois da infección (PI).Ratos infectados con PBS.Os taquizoítos ME49 cultiváronse en células suplementadas con 100 μg/ml de penicilina (Gibco/BRL, Grand Island, NY, EUA), 100 μg/ml de estreptomicina (Gibco/BRL) e 5% de suero fetal bovino (Lonza, Walkersville, MD) .., EUA) a 37 °C e 5% de dióxido de carbono.Despois do cultivo en células Vero, os taquizoítos ME49 pasáronse dúas veces por unha agulla de calibre 25 e despois por un filtro de 5 µm para eliminar restos e células.Despois do lavado, os taquizoítos foron resuspendidos en PBS44.Os quistes tisulares da cepa ME49 de Toxoplasma gondii mantivéronse mediante inxección intraperitoneal de quistes illados do cerebro de ratos C57BL/6 infectados (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Corea).Os cerebros de ratos infectados con ME49 recolléronse despois de 3 meses de PI e picáronse ao microscopio para illar quistes.Os ratos infectados mantivéronse en condicións especiais libres de patóxenos (SPF) na Escola de Medicina da Universidade Nacional de Seúl.
O ARN total foi extraído de exosomas derivados de BV2, células e tecidos BV2 mediante o kit miRNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Alemaña) segundo as instrucións do fabricante, incluíndo o tempo de incubación para a etapa de elución.A concentración de ARN determinouse nun espectrofotómetro NanoDrop 2000.A calidade das micromatrices de ARN avaliouse mediante un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Holanda).
Preparouse DMEM cun 10% de FBS pobre en exosomas mediante ultracentrifugación a 100.000 g durante 16 horas a 4 °C e filtróuse a través dun filtro de 0,22 µm (Nalgene, Rochester, NY, EUA).Cultiváronse células BV2, 5 × 105, en DMEM que contén un 10% de FBS esgotado en exosomas e un 1% de antibióticos a 37 °C e un 5% de CO2.Despois de 24 horas de incubación, engadíronse ás células taquizoítos da cepa RH ou ME49 (MOI = 10) e os parasitos non invasores elimináronse nunha hora e rexíronse con DMEM.Illáronse os exosomas das células BV2 mediante centrifugación diferencial modificada, o método máis utilizado.Resuspender o sedimento do exosoma en 300 µl de PBS para a análise de ARN ou proteínas.A concentración de exosomas illados determinouse mediante un kit de ensaio de proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL, EUA) e un espectrofotómetro NanoDrop 2000.
Os precipitados de células BV2 ou exosomas derivados de BV2 lisáronse en solución de extracción de proteínas PRO-PREP ™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Corea) e as proteínas cargáronse en xeles de poliacrilamida SDS ao 10 % de Coomassie tinguidos de azul brillante.Ademais, as proteínas foron transferidas a membranas de PVDF durante 2 horas.Os Western blots validáronse usando o anticorpo Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA) como marcador exosomal.Como anticorpo secundario utilizáronse IgG anti-rato de cabra conxugada con HRP (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, EUA) e un analizador de imaxes luminiscentes LAS-1000 plus (Fuji Photographic Film, Tokio, Xapón)..Realizouse a microscopía electrónica de transmisión para estudar o tamaño e a morfoloxía dos exosomas.Preparáronse exosomas illados das células BV2 (6,40 µg/µl) en mallas recubertas de carbono e tinguironse negativamente con acetato de uranilo ao 2% durante 1 min.As mostras preparadas observáronse a unha tensión de aceleración de 80 kV utilizando un JEOL 1200-EX II (Tokio, Xapón) equipado cunha cámara CCD Erlangshen ES1000W (Gatan, Pleasanton, CA, EUA).
Os exosomas derivados de BV2 tinguironse usando o kit de enlace fluorescente vermello PKH26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) durante 15 minutos a temperatura ambiente.As células U87, 2 × 105, con exosomas marcados con PKH26 (vermello) ou sen exosomas como control negativo, incubáronse a 37 °C durante 24 horas nunha incubadora ao 5 % de CO2.Os núcleos das células U87 tinguironse con DAPI (azul), as células U87 fixéronse en paraformaldehído ao 4% durante 15 min a 4 ° C e despois analizáronse nun sistema de microscopio confocal Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Alemaña).observable.
O ADNc foi sintetizado a partir de ARNsi mediante a síntese da primeira cadea de siRNA Mir-X e o kit SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Xapón).A PCR cuantitativa en tempo real realizouse mediante o sistema de detección de PCR en tempo real iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) utilizando cebadores e modelos mesturados con SYBR Premix.O ADN foi amplificado durante 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 s e recocido a 60 °C durante 60 s.Os datos de cada reacción de PCR analizáronse mediante o módulo de análise de datos do software do sistema óptico iQ™5 (Bio-Rad).Os cambios relativos na expresión xénica entre os xenes diana seleccionados e a β-actina/ARNsi (e U6) calculáronse mediante o método da curva estándar.As secuencias de cebadores utilizadas móstranse na táboa 1.
Sementáronse 3 x 104 células de glioma U87 en placas de 96 pocillos e mesturáronse con exosomas infectados con Toxoplasma derivados de BV2 (50 μg/mL) ou exosomas non pulsos derivados de BV2 (50 μg/mL) como controis ás 12, 18 e 36 horas. .A taxa de proliferación celular determinouse mediante o Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Xapón) (Figuras complementarias S1-S3) 46 .
Adquiríronse ratos espidos BALB/c femias de 5 semanas de Orient Bio (Seongnam-si, Corea do Sur) e mantivéronse individualmente en gaiolas estériles a temperatura ambiente (22±2 °C) e humidade (45±15 °C).%) a temperatura ambiente (22±2°C) e humidade (45±15%).Realizáronse un ciclo de luz de 12 horas e un ciclo escuro de 12 horas baixo SPF (Centro Animal da Escola de Medicina da Universidade Nacional de Seúl).Os ratos dividíronse aleatoriamente en tres grupos de 5 ratos cada un e todos os grupos foron inxectados por vía subcutánea con 400 ml de PBS que contén 1 x 107 células de glioma U87 e BD Matrigel™ con factor de crecemento reducido (BD Science, Miami, FL, EUA).Seis días despois da inxección do tumor, 200 mg de exosomas derivados de células BV2 (con/sen infección por Toxoplasma) foron inxectados no sitio do tumor.Vinte e dous días despois da infección do tumor, o tamaño do tumor dos ratos de cada grupo foi medido cun calibre tres veces por semana e o volume do tumor foi calculado pola fórmula: 0,5 × (ancho) × 2 × lonxitude.
Análise da expresión de microARN mediante matriz de miRNA miRCURYTM LNA, matrices has, mmu e rno de 7ª xeración (EXIQON, Vedbaek, Dinamarca) que abarcan 1119 ratos ben caracterizados entre 3100 sondas de captura de miRNA de humanos, ratos e ratas.Durante este procedemento, elimináronse de 250 a 1000 ng de ARN total do 5′-fosfato mediante un tratamento con fosfatase alcalina intestinal de tenreiro seguido do marcado con colorante fluorescente verde Hy3.Despois hibridizáronse as mostras marcadas cargando láminas de microarrays mediante un kit de cámara de hibridación (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) e un kit de láminas de hibridación (Agilent Technologies).A hibridación realizouse durante 16 horas a 56 °C, despois laváronse as micromatrices segundo as recomendacións do fabricante.Despois escaneáronse as láminas de microarrays procesadas usando un sistema de escáner de microarrays Agilent G2565CA (Agilent Technologies).As imaxes dixitalizadas importáronse mediante o software Agilent Feature Extraction versión 10.7.3.1 (Agilent Technologies) e cuantificouse a intensidade de fluorescencia de cada imaxe mediante o ficheiro GAL correspondente do protocolo Exiqon modificado.Os datos de microarrays para o estudo actual están depositados na base de datos GEO co número de acceso GPL32397.
Os perfís de expresión dos miRNAs exosomáis maduros na microglia de cepas RH ou ME49 infectadas con Toxoplasma foron analizados mediante varias ferramentas de rede.Os miRNAs asociados ao desenvolvemento do tumor foron identificados mediante miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) e filtráronse cunha intensidade de sinal normalizada (log2) superior a 8.0.Entre os miARN, descubriuse que os miARN expresados ​​de forma diferencial eran máis de 1,5 veces alterados pola análise de filtros dos miARN alterados por cepas RH ou ME49 infectadas con T. gondii.
As células sementáronse en placas de seis pozos (3 x 105 células/pozo) en opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, EUA) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA).Cultiváronse as células transfectadas durante 6 horas e despois cambiouse o medio a medio completo fresco.As células recolléronse 24 horas despois da transfección.
A análise estatística realizouse principalmente mediante o test t de Student con software Excel (Microsoft, Washington, DC, EUA).Para a análise experimental de animais, realizouse un ANOVA bidireccional usando o software Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA). Os valores de p < 0,05 foron considerados estatisticamente significativos. Os valores de p < 0,05 foron considerados estatisticamente significativos. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Os valores de p <0,05 consideráronse estatisticamente significativos. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P = < 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Os valores de p <0,05 consideráronse estatisticamente significativos.
Todos os protocolos experimentais utilizados neste estudo foron aprobados polo Consello de Revisión Institucional da Escola de Medicina da Universidade Nacional de Seúl (número IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Incidencia e mortalidade mundial do cancro estimadas en 2018: fontes e métodos de GLOBOCAN.Interpretación.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Unha visión dos factores de risco dos tumores cerebrais e as súas intervencións terapéuticas. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Unha visión dos factores de risco dos tumores cerebrais e as súas intervencións terapéuticas.Rashid, S., Rehman, K. e Akash, MS Unha revisión dos factores de risco para os tumores cerebrais e as principais intervencións terapéuticas. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Comprensión profunda dos factores de risco de tumores cerebrais e intervencións terapéuticas.Rashid, S., Rehman, K. e Akash, MS Unha revisión dos factores de risco para os tumores cerebrais e as principais intervencións terapéuticas.Ciencia biomédica.Farmacéutico.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interaccións bacterianas-virais en cancros do tracto xenital feminino e orodixestivo humano: un resumo da evidencia epidemiolóxica e de laboratorio. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interaccións bacterianas-virais en cancros do tracto xenital feminino e orodixestivo humano: un resumo da evidencia epidemiolóxica e de laboratorio.Kato I., Zhang J. e Sun J. Interaccións bacterianas-virais no cancro do tracto gastrointestinal humano e do tracto xenital feminino: un resumo de datos epidemiolóxicos e de laboratorio. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J.总结。 Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interacción bacteriana-viral na dixestión da cavidade oral humana e o tracto reprodutor feminino: resumo da ciencia da enfermidade popular e probas de laboratorio.Kato I., Zhang J. e Sun J. Interaccións bacterianas-virais no cancro gastrointestinal humano e cancro xenital feminino: un resumo de datos epidemiolóxicos e de laboratorio.Cancro 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Da infección ao cancro: como os virus tumorais de ADN alteran o metabolismo central do carbono e dos lípidos da célula hóspede. Magon, KL & Parish, JL Da infección ao cancro: como os virus tumorais de ADN alteran o metabolismo central do carbono e dos lípidos da célula hóspede.Mahon, KL e Parish, JL Infección por lume contra o cancro: como os virus tumorais baseados no ADN alteran o metabolismo central do carbono e dos lípidos da célula hóspede. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质䣂谢 Magon, KL & Parish, JL Da infección ao cancro: como os virus tumorais de ADN alteran o metabolismo central do carbono e dos lípidos da célula hóspede.Mahon, KL e Parish, JL Incendios infección ao cancro: como os virus do tumor de ADN alteran o metabolismo central do carbono e dos lípidos nas células hóspedes.Bioloxía aberta.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Estróxenos catecol de esquistosomas e trematodos hepáticos e cancro asociado a helmintos.diante.quente por dentro.5, 444 (2014).